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甲基化特异性基因扩增检测过程中的质量控制被引量：2: 2006年; 目的构建adenomatous polyposis coli(APC)基因启动子1A的甲基化阳性质粒标准品,对甲基化特异性基因扩增(meth-ylation specific PCR,MSP)的检测灵敏度进行质量控制。方法对脐血淋巴细胞DNA转甲基并化学修饰,制备甲基化阳性和阴性模板,MSP后获得目的片段,克隆到pMD18-T质粒载体,测序筛选阳性和阴性质粒标准品,紫外分光法对标准品定量,对10倍梯度稀释的质粒进行SYBR Green I荧光定量PCR来获得弱阳性质控品,对36份组织样本进行MSP检测。结果将MSP后电泳能显示的质粒(105拷贝/ml)作为弱阳性质控品。在加入弱阳性质控品后,2例阴性的样本最终定为阳性;11例未定结果的样本最终7例定为阳性,4例定为阴性。36例样本无质控品前的甲基化阳性率为25%,有质控品后的阳性率为50%,两次结果差异显著(P=0.001)。结论构建了携带甲基化阳性的APC基因启动子的质粒标准品并制备了低拷贝的弱阳性质控品,可以对MSP检测灵敏度进行质量控制,降低了检测的假阴性率。; 魏源华潘世扬王贤陈丹张丽霞黄珮珺童明庆张寄南; 关键词：甲基化特异性PCR APC基因

氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的制备与鉴定: 2006年; 目的制备抗氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)单克隆抗体(Ox-LDL mcAb)。方法以Ox-LDL为抗原,免疫Balb／c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌抗Ox-LDL mcAb的杂交瘤细胞,用protein A柱亲和层析法纯化腹水中mcAb,用ELISA,western- blot等鉴定其生物学活性。结果获得2株能稳定分泌Ox-LDL mcAb的杂交瘤细胞(6E9D,7G3C),均为IgG1亚型;染色体数目为100-106条;腹水效价为105;western-blot分析和ELISA检测证实2株mcAb均与Ox-LDL有较高的特异性。结论本实验成功制备了2株抗Ox-LDL特异性的mcAb,可用于Ox-LDL免疫检测方法的建立。; 黎青潘世扬刘志忠卞智萍徐晋丹顾春荣杨笛张寄南; 关键词：氧化低密度脂蛋白单克隆抗体 WESTERN-BLOT

芯片技术用于APC基因启动子甲基化定量检测被引量：3: 2006年; 目的研制抑癌基因APC启动子1A的甲基化定量检测芯片,对临床标本进行初步定量检测分析。方法采用脐带血DNA克隆体作为阴性、阳性质控品建立芯片,提取6例健康人的肺组织DNA、6例肺癌患者的肺组织和癌组织DNA,进行亚硫酸盐化学修饰,以甲基化特异性引物进行基因扩增,与探针杂交检测,并进行甲基化特异性序列分析。结果甲基化阳性、阴性质控品的芯片检测与测序结果吻合。687、707、714、719和726共5个位点的荧光强度标准曲线的R2为0．93-0．99。687、707、714、719和726共5个位点非甲基化的检测范围:(0±8．7)％、(0±17．6)％、(0±17)％、(0±13)％、(0±8)％;甲基化杂合型的检测范围:(50±3．6)％、(50±6．9)％、(50±3．5)％、(50±8．5)％、(50±7．3)％。标本的芯片检测与测序结果一致。结论本研究首次建立了以微阵列技术为基础的APC基因启动子甲基化定量检测芯片。; 王贤潘世扬陆祖宏程璐魏源华张丽霞陈丹张寄南; 关键词：APC基因甲基化芯片

人心脏型脂肪酸结合蛋白的纯化与鉴定被引量：3: 2007年; 目的:以往的心脏型脂肪酸结合蛋白多来自牛、鼠等动物心肌组织,本实验构建了人左心室心肌组织纯化心脏型脂肪酸结合蛋白的新方法。方法:实验于2005-01/03在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。①实验材料:人心室肌由南京医科大学第一附属医院心血管病研究所提供。②实验过程:取20g人左心室肌在缓冲液中匀浆,多步骤离心后以(NH4)2SO4进行盐析→再次离心→沉淀缓冲液重悬透析得蛋白粗提液→Sephadex G-75凝胶过滤→电泳确定主要蛋白条带的收集管号合并收集→QSepharose Fast Flow阴离子交换层析→聚乙二醇浓缩→缓冲液透析得人心脏型脂肪酸结合蛋白。③实验评估:以SIGMA公司人心脏型脂肪酸结合蛋白为对照标准品;以Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定相对分子质量;以鼠抗人脂肪酸结合蛋白单克隆抗体及羊抗鼠IgG对其进行Western印迹检测鉴定其特异性。结果:①Sephadex G-75凝胶过滤柱层析结果:各组分经Tricine-SDS-PAGE电泳检测证实,部分收集管中存在相对分子质量约14400的人心脏型脂肪酸结合蛋白。②阴离子交换柱层析结果:在洗脱液NaCl浓度达6mmol/L时,出现蛋白峰,人心脏型脂肪酸结合蛋白被洗脱;NaCl浓度达20mmol/L时,蛋白峰降至基线,蛋白洗脱结束。③纯化的人心脏型脂肪酸结合蛋白鉴定结果:经电泳显示其相对分子质量约为14000,纯度约为90%;Western印迹证实其可被抗人脂肪酸结合蛋白单克隆抗体特异识别,与对照标准品SIGMA公司人心脏型脂肪酸结合蛋白结果一致。实验从20g湿重心室肌中共纯化得到15.4mg心脏型脂肪酸结合蛋白,得率为0.77mg/g。结论:Sephadex G-75凝胶过滤柱层析及阴离子交换柱层析相结合,可用于人心脏型脂肪酸结合蛋白的纯化。; 季鹏顾春荣卞智萍陈相健张寄南杨笛; 关键词：载体蛋白质类

人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立被引量：24: 2007年; 目的建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量。方法构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量。结果本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数(CV)11%,批间CV17%。结论成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测。; 陈丹潘世扬张丽霞高丽谢而付黄?戎国栋; 关键词：血浆DNA 实时荧光定量PCR 双重PCR

非小细胞肺癌组织中抑癌基因APC表达的研究被引量：1: 2005年; 目的探讨非小细胞肺癌组织中APC基因mRNA转录水平。方法采用RT-PCR技术,以SybrgreenⅠ为荧光染料,beta-actin基因为内参照,对17例临床确诊的非小细胞肺癌病例的正常肺组织和肿瘤组织的APC基因mRNA进行实时荧光定量检测。计算每份标本Ct(APC)/Ct(beta-actin)比值,比较每份病例正常肺组织和肿瘤组织比值之间的差值(d),配对t检验。结果在17例病例中,APCmRNA在肺癌组织中的表达较正常肺组织明显降低(d=-0.29,P<0.05)。结论肺癌患者正常肺组织和肿瘤组织APC基因转录存在明显差异,肺癌组织APC基因转录水平降低。; 姚孝明潘世扬魏源华张寄南束永前黄珮珺童明庆; 关键词：APC基因逆转录聚合酶链反应

实时荧光定量PCR在人血液循环DNA检测中的应用被引量：8: 2007年; 循环DNA主要存在于人血浆和血清等体液中，在多种人类疾病中含量升高，具有临床诊断意义和预后判断价值。本研究以人工重组质粒DNA为内参照物，建立双重实时荧光定量PCR检测方法，对健康人血浆和血清DNA含量进行定量测定。; 陈丹潘世扬张丽霞高丽谢而付黄珮珺戎国栋; 关键词：DNA检测 PCR检测方法健康人血浆实时荧光定量循环DNA

DNA指纹分析在肿瘤临床诊断中的应用研究进展: 2005年; 史燕顺潘世扬; 关键词：DNA指纹分析 DNA指纹技术 DNA指纹图谱基因组DNA 体细胞遗传性

体外培养人单个核细胞分泌IFN-γ水平的观察: 2005年; 目的对体外培养的人脐带血和外周血单个核细胞(MNC)以植物血凝素(PHA)刺激,观察培养上清中IFNγ含量变化。方法常规Ficoll离心法分离人MNC,接种24孔培养板,同时加入PHA,体外培养5d,计数不同培养时间的细胞总数;ELISA法测定不同培养时间上清中的IFNγ含量。结果经PHA刺激后,脐血MNC数量约扩增了12倍,单位细胞量所分泌的IFNγ是健康人血浆水平的30倍。而健康人外周血MNC数量约扩增了5倍。单位细胞量所分泌的IFNγ是健康人血浆水平的15倍。结论与人外周血MNC相比,人脐带血MNC对PHA刺激具有良好的反应性,经PHA刺激后可分泌更高水平的IFNγ,表明其在移植物抗白血病(GVL)效应中起一定作用。; 王宏潘世扬黄珮珺戎国栋张杰陆琳文怡蒋理童明庆; 关键词：人脐带血单个核细胞植物血凝素体外培养

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江苏省政府“135”重点实验室科研基金(SK200205)

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