国家自然科学基金(30370422)
- 作品数：25 被引量：49H指数：4
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- 人源乳腺癌单链抗体基因的构建
- 2006年
- 目的:构建人源抗乳腺癌单链抗体(scfv)基因片断。方法:首先利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织提取总RNA,然后通过RT-PCR分别扩增VH和VL基因片断,再将经纯化的VH和VL基因片断通过“重叠-延伸-拼接PCR”(SOE-PCR)而形成单链抗体(scfv)基因片断。结果:构建了750bp的人源抗乳腺癌单链抗体(scfv)基因片断。结论:成功地构建了人源抗乳腺癌单链抗体基因片断,为进一步构建人源抗乳腺癌单链抗体库提供了试验基础。
- 唐树彬段红蒲军李少林彭志平
- 关键词：乳腺癌单链抗体
- 噬菌体展示技术与肿瘤被引量：1
- 2005年
- 随着噬菌体展示技术应用范围的不断扩大和研究的不断深入,它在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用。构建噬菌体抗体能为肿瘤免疫诊断和免疫治疗提供理想载体分子;通过此技术体外和体内筛选可发现肿瘤组织特有的分子标识物,从而为肿瘤的靶向治疗打下良好的基础。
- 段红李少林
- 关键词：噬菌体肿瘤肽库
- 抗CCR7单链抗体的筛选及初步鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的从噬菌体抗体库中筛选抗CCR7单链融合抗体,并对其生物学特性进行初步检测。方法PCR检测大肠杆菌中ScFv基因插入率;琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;分别以乳腺癌细胞及CCR7多肽片段为靶抗原对抗体库进行4轮和3轮筛选富集。将阳性克隆转化E.coliHB2151进行可溶表达。抗体亲和层析纯化后,经Western blot鉴定,通过ELISA法检测可溶性ScFv抗体的免疫活性。免疫细胞化学和放射免疫显像鉴定scFv抗体与乳腺癌细胞结合的特异性。结果ScFv基因插入率为90%(18/20),双酶切鉴定检测到目的条带。经4轮细胞筛选,3轮抗原筛选抗CCR7抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,在E.coliHB2151中实现可溶表达。Western blot结果显示获得抗体相对分子质量为34ku左右。免疫细胞化学检测与放射免疫显像均证实单链抗体与表达CCR7的乳腺癌细胞MDA-MB-435s特异性结合。结论成功从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗CCR7单链抗体。抗体在体内体外均与肿瘤细胞表达特异抗原结合。
- 樊春波李少林彭志平罗弋曹辉王洁
- 关键词：噬菌体抗体库单链抗体CCR7淋巴结转移抗体筛选
- 小鼠白介素-12真核表达质粒的构建及其表达被引量：5
- 2006年
- 目的:构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(mIL-12)的质粒,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:通过聚合酶链反应(PCR)扩增质粒pORF-mIL-12(Elas-ti),双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒上,mIL-12受pcDNA3.1(+)中mCMV启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后将其转染小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)测其表达。结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。结论:pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达。
- 尹晓玲孙世良李少林彭志平蒋明东
- 关键词：白细胞介素12小鼠基因表达
- 人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选被引量：3
- 2008年
- 目的构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选肺腺癌细胞A549特异性单链抗体。方法利用肺腺癌患者癌旁淋巴结组织构建肺腺癌噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别A549细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化E.coli HB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS-PAGE、Western blot鉴定,通过ELISA法鉴定其与人肺腺癌细胞结合的特异性。结果成功构建了1个4.6×107的噬菌体抗体库。在筛选过程中,肺腺癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第5轮为第1轮的181倍。在E.coli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体相对分子质量为30×103左右。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与A549细胞结合,而不与MDA-MB-435细胞结合。结论从肺腺癌病人癌肿周围淋巴结扩增免疫球蛋白基因成功地构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到肺腺癌特异性抗体。
- 庞华罗弋李少林
- 关键词：噬菌体抗体库单链抗体肺腺癌
- 抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv)。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。
- 罗弋庞华李少林曹辉李淑杰王树斌樊春波
- 关键词：单链抗体肺腺癌
- 重组白介素-12治疗小鼠Lewis肺癌的实验研究被引量：2
- 2006年
- 背景与目的:白介素-12(interleukin-12,IL-12)是具有抗瘤活性的细胞因子,本研究建立稳定表达小鼠IL-12(murineinterleukin-12,mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,评估mIL-12重组质粒及LLC/mIL-12瘤苗治疗小鼠Lewis肺癌移植瘤的疗效。方法:脂质体转染LLC获得LLC/mIL-12瘤苗。于C57BL/6小鼠皮下接种LLC细胞2×106个,成瘤后将小鼠随机分成4组(n=10),第1、4、7天瘤内注射质粒或瘤苗,第14天处死小鼠,观察肿瘤生长曲线、脾细胞中CTL细胞和NK细胞活性以及肿瘤浸润淋巴细胞。结果:LLC/mIL-12瘤苗组和pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒组肿瘤体积显著缩小,mIL-12能增强NK细胞和CTL细胞活性,两者均以LLC/mIL-12治疗组更显著,LLC/mIL-12和pcDNA3.1(+)-mIL-12治疗组有大量CD4+、CD8+淋巴细胞浸润。结论:mIL-12基因能增强NK细胞和CTL活性,LLC/mIL-12及pcDNA3.1(+)-mIL-12均能产生抗瘤免疫反应,且前者作用更强。
- 尹晓玲段红彭志平孙世良李少林
- 关键词：白介素-12基因治疗LEWIS肺癌移植瘤小鼠
- 全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的:我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库,本文目的在于对该抗体库进行鉴定,筛选食管癌抗体,同时对抗体的活性进行检测。方法:PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率;1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选;将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化;用SDS-PAGE测定该抗体的相对分子量;用Western blot鉴定该抗体;用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果:scFv基因插入率为91.7%;酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色;在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织,而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论:利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。
- 段红庞华尹晓玲彭志平李少林
- 关键词：噬菌体抗体库单链抗体食管癌
- ^(131)I标记抗肺癌单克隆抗体1E2在荷瘤小鼠体内分布及对小鼠移植瘤作用被引量：2
- 2008年
- 目的:分析碘-131(131I)标记抗肺癌单克隆抗体1E2在荷Lewis肺癌小鼠体内分布,评估瘤内注射碘-131标记抗肺癌单克隆抗体1E2(131I-1E2)对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用。方法:C57BL/6小鼠右后腿皮下接种Lewis肺癌细胞(LLC)1×106/只,建立荷Lewis肺癌小鼠模型,免疫组化检测Lewis肺癌细胞(LLC)膜上1E2抗原-氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)的表达。131I标记1E2单抗(氯胺T法),检测标记率、放化纯度、放射性比活度。荷瘤小鼠尾静脉注射标记抗体131I-1E218.5MBq,观察其不同时间点在小鼠体内的分布。成瘤后小鼠随机分为4组,分别瘤内注射生理盐水0.1ml(空白对照),1E2单抗3μg(阳性对照),131I-IGg18.5MBq(阴性对照),131I-1E218.5MBq。治疗后每周2次测定肿瘤大小,21天后处死小鼠观察肿瘤组织病理学改变,检测肿瘤体积、重量,计算抑瘤率。结果:1E2抗原-CPS1主要在肿瘤细胞膜表达,131I-1E2标记率为67.73%,放化纯度为95.63%。131I-1E2主要分布在肿瘤组织,治疗后3周试验组肿瘤体积为(0.75±0.15)cm3,重量为(1.60±0.19)g,抑瘤率78.30%,与对照组间比较差异有统计学意义(P<0.01),对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组与对照组间病理学差异显著。结论:131I-1E2瘤内注射可抑制肿瘤的生长,具有潜在的临床应用价值,有可能成为新的肿瘤治疗靶向药物。
- 尹晓玲彭志平文明李少林
- 关键词：LEWIS肺癌放射免疫疗法
- ^(131)I标记抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌体抗体在荷瘤裸鼠体内的分布及其对肿瘤生长的抑制作用被引量：2
- 2010年
- 目的研究抗Peroxiredoxin I(PrxI)肺腺癌相关单链抗体体外对肺腺癌细胞的增殖抑制;观察131I标记抗体在肺腺癌裸鼠模型体内分布、靶向显像及体内抑瘤作用。方法放射性核素计数法测定单链抗体细胞内摄水平;MTT法及流式细胞仪检测单链抗体抑制肺腺癌A549细胞生长情况;免疫印迹法检测单链抗体作用于A549细胞后对细胞内PrxI表达水平的影响。放射性核素131I标记纯化抗体,进行荷瘤裸鼠体内分布、SPECT放免显像及病理切片观察抑瘤作用。结果单链抗体干预后细胞PrxI蛋白表达水平较对照组下降(P<0.05)。体内分布研究表明单链抗体与肺腺癌组织有效结合。荷瘤裸鼠尾静脉注射131I标记抗体48h后,瘤/血和瘤/肌肉放射性比值均达到最大值4.06±0.13和5.17±0.97。SPECT示抗体注射后48hT/NT值明显高于12h、24h和72h(F均>86,P均<0.01)。治疗4周后,131I标记抗体治疗组肿瘤体积为(0.68±0.17)cm3,质量为(1.58±0.21)g,抑瘤率56.8%,与对照组比较有统计学差异。结论抗PrxI肺腺癌单链抗体能有效抑制肺腺癌细胞生长,131I标记单链抗体在体内能抑制肿瘤生长。
- 李淑杰罗弋庞华李少林
- 关键词：肺腺癌PEROXIREDOXINI放免显像放免治疗
