河北省自然科学基金(C2008001070)
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- 从噬菌体展示十二肽库中筛选钠泵α_1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽
- 2010年
- 目的获得人钠泵α1亚基M1-M2膜外区的特异性结合肽,以阻断或拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用,为高血压的治疗提供理论和实验依据。方法以人工合成的钠泵α1亚基M1-M2膜外区多肽(ATEEEPQNDN-LGGGS)为靶分子,从噬菌体随机12肽库淘选能与之特异性结合的多肽,通过双夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)和浓度依赖性实验鉴定噬菌体阳性克隆,提取DNA测序,推导其氨基酸序列,并检测其对哇巴因的竞争性拮抗作用。结果从噬菌体12肽库中筛选出4个阳性噬菌体克隆,测序后其氨基酸序列完全一致,均为:WHWRNPDF-WYLK。哇巴因竞争性抑制试验显示,获得的噬菌体展示肽可以与哇巴因竞争钠泵α1亚基M1-M2膜外区结合表位,阻止哇巴因与钠泵结合。结论获得了人钠泵α1亚基M1-M2膜外区的特异性结合肽,它能竞争性抑制哇巴因与钠泵的结合,为进一步探讨钠泵的作用机制及高血压的治疗奠定了基础。
- 刘志文连易水李蝉张玥王永利王伟赵兴茹崔京霞
- 关键词：钠泵噬菌体随机肽库结合肽
- 人钠泵α2亚基M4～M5区片段的克隆、原核表达与纯化
- 2010年
- 目的构建钠泵α2亚基第4跨膜区与第5跨膜区之间的蛋白结构域M4～M5的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法通过PCR反应和酶切技术,构建表达载体pET28b(+)-M4-5,并于大肠杆菌E.coliRosetta2进行表达,用6mol/L盐酸胍对表达形成的不溶包涵体进行变性,梯度稀释复性后,用Ni-NTA亲和柱进行纯化,得到目的蛋白,用Westernblot分析表达产物,并采用无机磷法测定其ATP酶活性。结果重组表达载体pET28b(+)-M4-5经酶切与测序鉴定证实构建成功;导入大肠杆菌Rosetta2进行表达,表达产物相对分子质量为52×103左右,与预期值相符,表达量占细胞全蛋白的30%左右;SDS-PAGE分析表明,表达产物主要以包涵体形式存在,亲和柱纯化后,目的蛋白的纯度在95%以上;Westernblot分析表明表达产物与抗His抗体特异性结合;重组蛋白的ATP酶活性为(15.3±1.8)mmol·(g·h)-1。结论构建了原核表达载体pET28b(+)-M4-5,并在大肠杆菌Rosetta2中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的M4～M5融合蛋白。
- 刘志文连易水张玥王永利王伟赵兴茹崔京霞
- 关键词：表达纯化包涵体复性
