国家自然科学基金(31001084)
- 作品数：6 被引量：10H指数：2
- 相关作者：李德山徐黎明丁良君任桂萍李天鹤更多>>
- 相关机构：东北农业大学中国水产科学研究院黑龙江水产研究所国家知识产权局更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金哈尔滨市科技创新人才研究专项资金黑龙江省博士后科研启动基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- E-coli整合酶检测方法研究被引量：2
- 2012年
- 通过检测整合酶确定多重耐药大肠杆菌是否含有整合子。试验采用梯度PCR方法确定扩增整合酶最佳温度,以该温度扩增247株菌整合酶,并对PCR产物鉴定测序,确定整合酶类型。结果表明,247株菌中有158株菌扩增出了Ⅰ型整合酶,13株菌扩增出了Ⅱ型整合酶,总共有171株菌扩增出了整合酶基因。表明可通过PCR扩增整合酶的方法监测多重耐药大肠杆菌携带整合子的情况。
- 丁良君张秀英李德山付锐
- 关键词：整合酶大肠杆菌多重耐药整合子
- 抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测被引量：2
- 2013年
- 目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础。方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27b-A-hIL-1β-scFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白。利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力。结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化。得到纯度为72.05%、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白。ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖。结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础。
- 李天鹤任桂萍徐黎明周兵郭茉齐剑英张宇赵景壮于引航尹杰超李德山
- 关键词：单链抗体包涵体复性中和活性MTT
- 新型抗IL-1β和IL-17A双特异抗体的构建及特性鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）具有双重的生物学功能。本实验旨在设计并原核表达抗人IL-1β和抗人IL-17A的双特异性抗体（BsAb1／17），获得具有生物活性的BsAb1／17，为深入研究和利用双特异性抗体奠定基础。方法利用重叠PCR方法构建VH1VL17-CL和VL1VH17-CH1基因片段，并且在所用引物的5’和3’端附加NcoI和BamHI的酶切位点。将重叠PCR产物进行胶回收后用NcoI／BamHI进行双酶切，酶切产物再次胶回收，将其连接到用NcoI／BamHI消化的pET-27b载体上。将重组质粒pET-27b—VH1VL17-CL（petA）和pET-27b—VLIVH17-CH1（petB）转化到Eco1iRosetta中。SDS—PAGE和Westernb1ot进行鉴定，用rea1—timePCR检测其阻断IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-1β的活性，人IL-6定量酶联检测试剂盒检测其阻断IL-17A刺激HeLa细胞表达人IL-6的活性。结果DNA测序结果证明成功构建了pET-27b-VHIVL17-CL（petA）和pET-27b-VL1VH17-CH1（petB）表达质粒。petA、petB诱导产物主要以包涵体形式存在，成熟蛋白纯化产物纯度超过90％以上，经SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量约为38×10^3，与理论值相符。Western b1ot和ELISA结果证实双特异抗体BsAb1／17对IL-1β和IL-17A均具有很好的亲和力。通过RT-PCR检测证明其具有阻断IL-1β刺激人T细胞大量表达细胞因子IL-1β的活性，并且具有阻断IL-17A刺激HeLa细胞产生IL-6的活性。结论成功构建了同时抗IL-1β和IL-17A的双特异抗体，并利用大肠杆菌表达系统高效表达较高纯度的具有生物活性的双特异抗体。
- 王秋颖徐黎明任桂萍彭中宜丁良君孙阳陈睿李德山
- 关键词：双特异性抗体原核表达
- 具有中和活性的抗人IL-1β单链抗体的构建被引量：1
- 2011年
- 目的构建抗人IL-1β单链抗体(anti-hIL-1βscFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行生物学活性检测。方法使用PCR的方法从含有抗人IL-1β抗体基因的质粒中获得抗人IL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b中,构建重组表达载体pET-27b-hIL-1βscFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后诱导表达,经凝胶过滤色谱柱上复性得到可溶的抗人IL-1β的scFv蛋白。使用ELISA方法鉴定scFv抗体的特异性结合活性,使用Real time-PCR的方法检测scFv抗体的中和活性。结果成功地对抗人IL-1β单链抗体进行诱导、表达和复性,蛋白相对分子质量约为28 000。ELISA结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。Real time-PCR实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断人IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-18及IL-1β的作用。结论通过原核表达系统得到的抗人IL-1β单链抗体经复性后,与人IL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和活性,为进一步研究人IL-1β相关疾病及其治疗性抗体奠定了基础。
- 李宁徐黎明李天鹤任桂萍陈睿张宇阚方明叶贤龙谷学佳丁良君李德山
- 关键词：IL-1Β单链抗体包涵体复性中和活性
- 一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备
- 2011年
- 目的制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性。方法用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定。结果获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9 mol/L;ELISA及Real-time-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用。结论所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础。
- 孙阳谷学佳叶贤龙徐黎明陈睿任桂萍王秋颖丁良军李德山
- 关键词：单克隆抗体中和活性IL-6
- 抗鸡传染性法氏囊病病毒单链抗体库的构建及其中和抗体的筛选被引量：4
- 2014年
- 为构建抗鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的细菌展示单链抗体（scFv）库并筛选出具有高亲和力和中和活性的scFv。本研究从IBDV免疫鸡的法氏囊提取总RNA，采用RT-PCR的方法分别扩增鸡抗体的VH和VL编码序列，插入含有（Gly4Ser）3 linker的pTlinker载体中，再将VH-linker-VL片段亚克隆到细菌展示载体pBSD中。以FITC标记的VP2 蛋白为诱饵，通过流式细胞术筛选出5株阳性scFv，其氨基酸同源性为82.16 %～87.27 %。将5株scFv基因分别插入原核表达载体pET-27b（＋）中，构建重组表达质粒pET-IBDV-scFv。将其转化大肠杆菌Rosetta进行诱导和表达，该5株scFv相对分子质量均约为28 ku。此外，利用纯化的scFv包被于ELISA检测板中作为扑捉抗体，检测结果显示scFv对VP2蛋白和不同IBDV株均具有特异性结合能力。而且通过体外中和试验结果表明，仅有一株scFv具有病毒中和活性，可以有效阻断IBDV（B87 株）对鸡胚成纤维细胞（DF1）的感染。该研究结果为进一步研制IBDV治疗性抗体奠定了基础。
- 周兵李天鹤李宁徐黎明郭茉马蕾张瑛杰叶贤龙赵景壮衣春霖韩晓辉丁良君李德山
- 关键词：IBDV单链抗体中和活性
