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国家自然科学基金(31001059)

作品数：5 被引量：14H指数：2
相关作者：宋小凯严若峰李祥瑞徐立新马春晓更多>>
相关机构：南京农业大学更多>>
发文基金：国家自然科学基金江苏高校优势学科建设工程资助项目中央高校基本科研业务费专项资金更多>>
相关领域：农业科学更多>>

文献类型

  • 5篇期刊文章
  • 1篇会议论文

领域

  • 6篇农业科学

主题

  • 6篇捻转血矛线虫
  • 6篇线虫
  • 4篇基因
  • 2篇酶活性
  • 2篇酶活性分析
  • 2篇精氨酸激酶
  • 1篇动蛋白
  • 1篇新基因
  • 1篇疫苗
  • 1篇荧光
  • 1篇荧光定量
  • 1篇原核表达
  • 1篇原基因
  • 1篇实时定量PC...
  • 1篇实时荧光
  • 1篇实时荧光定量
  • 1篇实时荧光定量...
  • 1篇特性分析
  • 1篇排泄分泌抗原
  • 1篇系统进化

机构

  • 6篇南京农业大学

作者

  • 6篇徐立新
  • 6篇李祥瑞
  • 6篇严若峰
  • 6篇宋小凯
  • 2篇马春晓
  • 1篇牛延萍
  • 1篇王晶晶
  • 1篇闫峰宾
  • 1篇张振超
  • 1篇张志凯
  • 1篇高丽丽

传媒

  • 3篇南京农业大学...
  • 1篇畜牧与兽医
  • 1篇畜牧兽医学报
  • 1篇中国畜牧兽医...

年份

  • 1篇2015
  • 1篇2014
  • 4篇2012
共 5 条 记 录，以下是 1-6
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排序方式：
捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆、表达与酶活性分析
目的 为研究精氨酸激酶(arginine kinase,AK)在抗捻转血矛线虫感染中的作用奠定基础.方法 根据捻转血矛线虫精氨酸激酶基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR；将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序...
马春晓徐立新宋小凯李祥瑞严若峰
关键词：捻转血矛线虫精氨酸激酶基因克隆酶活性分析
捻转血矛线虫ES24抗原基因的克隆与表达特性分析
2012年
根据捻转血矛线虫ES24抗原基因序列(U64793.1)设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出大小约为670 bp的DNA片段。将该DNA片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果发现该基因与GenBank中已知的捻转血矛线虫24 ku ES抗原基因的相似性达96%～98%。将该基因的开放阅读框插入pET28a(+)载体中,获得原核表达质粒pET28/ES24,并转化大肠杆菌BL21。重组细菌用IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,结果表明该基因获得了表达,重组蛋白分子量大小约为25 ku。用实时荧光定量PCR技术对该基因在捻转血矛线虫的虫卵、第3期幼虫、雌虫和雄虫等不同发育阶段、不同性别虫体内的表达情况进行了定量分析,结果显示ES24基因在雄性成虫中表达量最高,雌虫和虫卵其次,在第3期幼虫中表达最低。
牛延萍高丽丽宋小凯徐立新李祥瑞严若峰
关键词：捻转血矛线虫排泄分泌抗原实时荧光定量PCR
捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建
2012年
根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。
严若峰闫峰宾王晶晶徐立新宋小凯李祥瑞
关键词：捻转血矛线虫肌动蛋白基因原核表达DNA疫苗
捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析被引量：5
2014年
根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果表明该基因获得了表达,重组融合蛋白相对分子质量大小约为60.3×103,主要以包涵体形式存在。Western blot分析显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。重组蛋白具有一定的酶活性,其最佳反应温度和pH值分别为30℃和7.5。结论:该重组蛋白表达成功并具有一定的抗原性和激酶活性。
马春晓张振超李祥瑞徐立新宋小凯严若峰
关键词：捻转血矛线虫精氨酸激酶酶活性
基于ITS序列的捻转血矛线虫系统进化分析被引量：7
2012年
为分析捻转血矛线虫ITS序列的变异与虫株特性之间的关系,对捻转血矛线虫不同药物抗性虫株(苯并咪唑类药物抗性虫株、伊维菌素抗性虫株、莫西菌素抗性虫株、药物敏感虫株)、不同宿主来源虫株(长颈鹿、牛、绵羊、山羊、牦牛)和不同地理位置(中国、美国、意大利、法国、也门、马来西亚、澳大利亚)的分离株,以及毛圆科的其他线虫的ITS序列进行了分析。结果发现捻转血矛线虫与毛圆科其他线虫的ITS-2基因的相似性高,基于该基因建立的系统进化树可以很好地区分毛圆科不同属的线虫;捻转血矛线虫的抗药性特点与其ITS-1基因的变异进化关系不大;不同地理位置的捻转血矛线虫分离株的ITS-2基因变异很小;从野生动物长颈鹿体内分离的捻转血矛线虫的ITS-1基因与家养反刍动物分离株的差异较明显。研究结果表明捻转血矛线虫ITS序列在种内相对保守,不同虫株间变异较小,在毛圆科线虫的分子分类中具有一定意义。
严若峰宋小凯徐立新李祥瑞
关键词：捻转血矛线虫ITS系统进化
捻转血矛线虫新基因Hcher-1的克隆与特性分析被引量：2
2012年
根据Caruorhabditis elegans、C.briggsae和Brugia malayi的her-1基因的保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597 bp的DNA片段。以此序列为基础,通过5'RACE和3'RACE技术分别获得该基因的5'端和3'端未知序列。将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫Hcher-1基因的全长cDNA,该基因全长1 091 bp,包含一个960 bp的最大开放阅读框(ORF)、67 bp 5'非翻译区和64 bp 3'非翻译区。根据该基因的ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出960 bp的DNA片段,序列测定结果与推导的ORF序列一致。将该ORF亚克隆到pET-28a(+)载体中,转化大肠杆菌Rosseta,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果分析发现融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达。以该重组蛋白免疫大鼠制备血清作为一抗,Western blot方法分析天然HcHER-1蛋白,结果发现在全虫抗原的相对分子质量为35×103处出现特异性条带,与其理论大小一致。用荧光定量PCR技术对该基因在捻转血矛线虫的虫卵、第3期幼虫、雌虫和雄虫等不同发育阶段和不同性别虫体内的表达情况进行了定量分析,结果显示Hcher-1在雄性成虫中表达量最高,虫卵和第3期幼虫其次,在雌性成虫中最低,仅为雄虫表达量的1/7～1/8。
张志凯徐立新宋小凯李祥瑞严若峰
关键词：捻转血矛线虫免疫原性实时定量PCR
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