福建省教育厅科技项目(JA07086)
- 作品数：4 被引量：7H指数：2
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- 用新生隐球菌荚膜相关蛋白10基因mRNA水平评估抗真菌药物疗效被引量：1
- 2010年
- 目的定量检测新生隐球菌(Cryptococcus neoformans,CN)的荚膜相关蛋白10(capsule associated protein 10,CAP10)基因mRNA,探索将其用于隐球菌性脑膜炎抗真菌药物疗效评估的可行性。方法构建重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10并制作标准曲线;建立荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)反应体系并对其进行评价。利用建立的FQ-PCR体系检测11例氟康唑联用5-氟胞嘧啶治疗、9例两性霉素B联用5-氟胞嘧啶治疗患者治疗前后脑脊液(CSF)CAP10 mRNA拷贝数的变化,并结合临床资料进行分析。结果建立的FQ-PCR体系适合于CAP10 mRNA拷贝数的测定。两性霉素B联合5-氟胞嘧啶治疗组CAP10 mRNA的拷贝数的log值治疗前为3.43±0.84,治疗后下降为2.35±0.85(P<0.05);氟康唑联合5-氟胞嘧啶治疗组治疗前为2.65±1.24,治疗后下降为1.84±1.07(P<0.05)。2组患者临床症状均明显改善。结论构建的新生隐球菌CAP10 mRNA的FQ-PCR定量检测体系适合于脑脊液标本的检测,为新生隐球菌感染患者抗真菌药物疗效的判断提供了新的依据。
- 杨福坤林旎戴琳孙江凌陈勇程祖建欧启水
- 关键词：新生隐球菌荧光定量PCR疗效判断
- RNA干扰隐球菌cap10基因的siRNA表达载体的构建与鉴定
- 2010年
- 目的构建cap10基因RNA干扰(RNAi)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,为将其应用于隐球菌的改造及隐球菌性脑膜炎的生物治疗奠定基础。方法根据GenBank发表的cap10基因序列,按照干扰模板设计原则,选择设计1条可形成发夹结构的核苷酸序列,克隆连接到空载体psilencer4.1-CMVneo中构建重组质粒ps4.1neo-cap10并测序鉴定。用LiAc化学法将重组质粒转染新生隐球菌细胞并用G418筛选。比较重组质粒转染前后新生隐球菌cap10基因表达量的变化。结果成功构建针对cap10基因的ps4.1neo-cap10,经测序证实符合预期设计;ps4.1neo-cap10转染组新生隐球菌内cap10基因表达(175534.6±47004.3)copies/μl明显低于空质粒转染组(321995.5±32611.8)copies/μl和空白组(562931.7±65928.4)copies/μl,P<0.05。结论成功构建cap10基因的shRNA表达载体,其可以明显抑制新生隐球菌细胞内cap10基因的表达。
- 肖玉鹏苏晓霁江凌程祖建欧启水
- 关键词：新生隐球菌RNA干扰
- 建立FQ-PCR定量体系检测新型隐球菌CAP10 mRNA被引量：2
- 2009年
- 目的建立荧光定量PCR(FQ-PCR)技术定量检测新型隐球菌(CN)的荚膜相关蛋白10(CAP10)基因mRNA,为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株(ATCC34874)中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准曲线。设计引物和探针,建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10,并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3.11X+38.84。批内重复性试验CV值为0.31%,批间重复性试验CV值为2.73%。FQ-PCR体系能特异扩增新型隐球菌,特异性好,该体系的线性范围为101copies/μL～108copies/μL。结论成功建立CN的CAP10 mRNA的定量检测方法;该方法重复性好,特异性强。
- 戴琳孙林旎陈勇江凌程祖建欧启水
- 关键词：逆转录聚合酶链反应
- 实时荧光定量PCR检测VAD1 mRNA评估新型隐球菌性脑膜炎的疗效被引量：4
- 2010年
- 目的 建立RT-FQ-PCR检测新型隐球菌VAD1 mRNA的方法 ,探讨定量测定VAD1 mRNA用于CNM疗效评估的可行性.方法 依据GenBank收录的新型隐球菌VAD1 mRNA全序列,设计引物和TaqMan探针,建立RT-FQ-PCR检测VAD1 mRNA的方法 .检测25例CNM患者和30例其他神经系统疾病对照组患者脑脊液,评价方法 的敏感度及特异度;检测25例CNM患者急性期与恢复期脑脊液中VAD1 mRNA的表达量,分析VAD1 mRNA与CNM治疗效果的关系.结果 建立的标准曲线相关系数为-0.997 9,检测下限为101 拷贝数/μl,高、中、低浓度质粒标准品批内CV值分别为0.65%、0.89%和1.23%;RT-FQ-PCR法检测新型隐球菌的敏感度为96%（24/25）,特异度为100%（30/30）;急性期VAD1 mRNA表达量为3.042±0.906,明显高于恢复期的2.187±0.665,差异有统计学意义（t=4.583,P＜0.01）.结论 本研究建立的RT-FQ-PCR方法 具有较高的敏感度、特异度和重复性,适合于新型隐球菌的VAD1 mRNA检测;VAD1 mRNA表达水平与CNM的治疗效果有关.
- 江凌李雯欧启水
- 关键词：DEAD-BOX
