国家自然科学基金(30070038)
- 作品数：18 被引量：48H指数：5
- 相关作者：董小平韩俊张宝云高晨张瑾更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心西安交通大学首都儿科研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 微管相关蛋白tau与朊蛋白的相互作用被引量：6
- 2006年
- 微管相关蛋白tau参与了许多神经退行性疾病的发生, 其中包括一些人类可传播性海绵状脑病. 为了探讨tau与朊蛋白（PrP）之间可能存在的关系, 首先通过GST pull-down和免疫共沉淀等技术发现重组tau蛋白可通过微管结合区与来源于正常叙利亚仓鼠脑组织中的正常细胞膜朊蛋白（PrP^C）和羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织的异常朊蛋白（PrP^Sc）相结合. 利用免疫共沉淀实验发现在正常和羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中存在tau蛋白与PrP^C和PrP^Sc的相互作用, 并且利用激光共聚焦方法检测到PrP和tau蛋白在CHO细胞内具有共定位的关系. 为了确定PrP与tau蛋白相互作用的部位, 构建了不同区域的PrP片段, 从而证明PrP与tau蛋白相互作用的区域位于PrP的N端序列（23～91 aa）. PrP与tau蛋白分子间相互作用的直接实验证据提示tau蛋白可能参与PrP的正常生理功能以及朊病毒病的病理过程.
- 韩俊张瑾姚海兰王小凡李锋高晨周伟张宝云董小平
- 关键词：朊蛋白蛋白相互作用
- 多种缺损及突变的PrP蛋白在杆状病毒中的表达和纯化被引量：9
- 2003年
- PrP蛋白多肽序列上存在有不同的功能区域 ,影响着蛋白质构象、理化特性和生物学功能。为了获得不同缺损及突变的仓鼠PrP蛋白 ,以PCR方法获得不同大小的PrP基因片段 ,利用PCR大引物点诱变法获得带有突变糖基化位点PrP序列。所有PCR产物测序鉴定正确后 ,分别与pFASTBAC Hb质粒连接 ,与穿梭载体DH10BAC转座 ,构建各种重组病毒。Westernblot证实 ,8种不同长度的仓鼠PrP蛋白可在昆虫细胞Sf9中表达 ,包括全序列的PrP1 2 31,信号肽缺失的PrP2 3 2 31;N端缺损的PrP90 2 31和PrP12 0 2 31;C端缺损的PrP1 199、PrP1 174和PrP1 16 0。糖基化位点突变 :PrP2 3 2 31(N181Q)。其中不带信号肽序列的PrP蛋白均呈HIS融合蛋白 ,而N端带有信号肽的PrP蛋白则不能与Ni NTA琼脂糖亲和层析柱结合 ,但可以同PrP特异性抗体发生免疫沉淀反应。这提示PrP信号肽序列在昆虫细胞中可能也发挥着与哺乳动物细胞相似的作用。不同缺损及突变的PrP蛋白的表达和纯化为进行蛋白生物学性状研究奠定了基础。
- 张瑾张福萍聂凯陈岚周伟刘勇董小平
- 关键词：PRP杆状病毒信号肽
- 羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠后半数致死量(LD_(50))的测定被引量：9
- 2006年
- 目的测定羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠后的LD50。方法将感染羊瘙痒因子263K的仓鼠脑组织用生理盐水制成10%(w/v)脑组织匀浆,梯度稀释后感染仓鼠,观察仓鼠的发病情况。以Reed-Muench公式计算LD50,用West-ern blot方法检测观察期结束后发病及仍存活的仓鼠脑组织、脾组织中抵抗蛋白酶K的PrPSc。结果当颅内接种稀释度由低到高变化时,仓鼠发病的潜伏期及病程同时也由短到长发生变化。发病仓鼠脑组织中可以检测到PrPSc,但是PrPSc的量在不同的组之间无太大差别。观察期结束后,仍存活的仓鼠脑组织中未检测到具有PK抗性的PrP信号。结论本实验室保存的羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠的LD50为9.2-log10LD50i.c.units/0.001g brain,即当对仓鼠颅内接种10μl羊瘙痒因子263K的10-9.2稀释液时,50%的仓鼠会死亡。
- 石琦张宝云高晨韩俊高永军周玉玲董小平
- 关键词：半数致死量
- Doppel(叠朊蛋白)与Prion疾病
- 2004年
- Doppel是近年发现的朊蛋白(PrP)类似蛋白,一级结构与PrPcC端的2/3有25％的同源性。一些PrP基因敲除的转基因小鼠由于Doppel高表达,引起神经细胞变性导致小鼠发生共济失调,从而推测Doppel可能与PrP一样在Prion疾病中发挥重要作用。
- 肖新莉刘勇董小平
- 关键词：DOPPEL转基因小鼠
- 超声处理对羊瘙痒病脑组织中PrP^(Sc)聚集状态的影响被引量：1
- 2004年
- 目的 研究超声处理对感染羊瘙痒症仓鼠脑组织中PrPSc聚集状态的影响 ,寻找产生PrPSc低聚体的条件。方法 裂解液制备脑组织提取物 ,用各种超声条件处理不同阶段的脑组织提取物 ;以蛋白酶消化后的Westernblot方法和图象分析系统观测PrPSc蛋白的分布和聚集状态。结果 适当的超声处理 (15s共 30次 )可增加脑组织匀浆上清中PrPSc含量 1 2 9～ 1 5 8倍 ;同样条件下超声处理可明显增加羊瘙痒因子 2 6 3K感染仓鼠脑组织匀浆上清中PrP蛋白总量 ,而对正常对照仓鼠脑组织匀浆上清中PrP蛋白总量影响不大 ;对经常规高速离心获得的PrPSc的超声处理显示约 90 %的PrPSc存在于离心上清液中。结论 对感染动物脑组织进行超声处理可增加PrPSc 的提取量 ,利于实验室检测。适当的超声处理可破碎大的相对分子质量的PrPSc聚集物 ,产生小的相对分子质量的PrPSc产物。
- 周晓勃高建梅高晨张宝云袁育康董小平
- 关键词：超声处理瘙痒病脑组织
- 帕金森病相关蛋白α-共核蛋白的可溶性表达、纯化及抗体制备被引量：1
- 2006年
- 目的利用分子克隆技术在原核细胞中表达α-共核蛋白(SNCP),并制备兔多克隆抗体。方法从人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA。利用PCR技术扩增获得SNCP的cDNA序列,测序正确后克隆至pQE-30-GST表达载体上,在大肠埃希菌中表达GST-SNCP融合蛋白。融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备特异性抗血清,并对该抗体进行检测。结果琼脂糖凝胶电泳显示获得的SNCP cD-NA序列为420 bp。SDS-PAGE和W estern b lot分析,表达的融合蛋白呈可溶性,相对分子质量约为45 000。以其为抗原制备的SNCP抗血清的ELISA效价达到1:32000,并且该抗体可与BALB/c小鼠脑组织中内源性SNCP发生特异性反应。结论人SNCP可在原核细胞中可溶性表达。用表达的蛋白制备获得特异性较好的SNCP抗血清,为进一步了解SCNP的结构和功能以及在中枢神经系统退行性疾病的作用提供了必要的实验基础。
- 黄银霞韩俊张晓光姚海兰王小凡张瑾张宝云董小平
- 关键词：Α-共核蛋白神经退行性变原核表达抗体制备
- PRNP基因八肽重复突变研究进展
- 2006年
- 某些遗传性朊病毒病,例如,家族性Creutzfeldt-Jakob病(fCJD)、GSS综合征均与PRNP基因八肽重复区插入突变相关。关于插入突变Prp分子的研究对于揭示遗传性朊病毒病发病机制具有重要意义。
- 韩露韩俊董小平
- 关键词：插入突变
- 载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究被引量：3
- 2005年
- 利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究。结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白。ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白(PrP23-231)在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端。这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路。
- 高晨韩俊石琦陈岚万言珍高永军陈建明姜慧英周伟张宝云董小平
- 关键词：抗体分子间相互作用
- 羊瘙痒病小鼠适应株139A可突破种属屏障颅内感染金黄地鼠被引量：6
- 2002年
- 羊瘙痒病感染因子可以根据疾病发生的潜伏期、临床病程、神经病理学特征以及PrPSc分子特征等分为不同的毒株,目前已经证实有20余种。在可传播性海绵状脑病的发病过程中存在着明显的种属屏障作用。将小鼠适应株139A颅内接种至金黄地鼠,以观测感染因子对种属屏障的突破及感染特征。在接种385～405天后,感染动物出现明显症状,与以往报道的金黄地鼠适应株263K不同,139A毒株发病动物出现严重的瘙痒,而无明显的共济失调。感染动物自出现明显症状到死亡的时间明显长于263K毒株感染金黄地鼠。进一步脑组织电镜和Westernblot检测证实,存在有羊瘙痒病相关纤维和PrP-res。这证明小鼠适应株139A可突破种属屏障感染金黄地鼠。经系统比较,139A和263K毒株在潜伏期、主要临床症状和临床病程显示出明显的差异,而PrP-res的泳动位置和糖基化比率差异不大,仅139A毒株的单糖基化分子位置似乎略高于263K。动态观测处于潜伏期的接种动物脑组织羊瘙痒病相关纤维和PrP-res,发现PrPSc的出现明显早于临床症状。
- 张宝云侯星生高晨高建梅周晓勃洪涛董小平
- 关键词：颅内感染金黄地鼠
- 羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达和分布变化研究被引量：1
- 2004年
- 为了探讨羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中星形胶质细胞和神经元的数量及功能改变,利用免疫印迹、免疫组化方法研究了胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(neuron specificenolase,NSE)在受染仓鼠各脑区中表达变化的特点,同时比较其与神经病理学改变及PrPSc沉积的关系。结果表明,感染终末期仓鼠的脑组织中GFAP表达量明显增高,与正常对照相比,大脑皮质、脑干和小脑区域GFAP着色细胞数量分别增高3 69、2 41和1 56倍。感染仓鼠脑组织NSE表达量低于正常对照,小脑、海马CA1区和大脑皮质NSE着色细胞数量分别仅为正常对照相应区域的22 5%、54 2%和53 9%。这些变化与PrPSc在脑组织中的沉积程度和空泡样变性程度相吻合。结果提示,GFAP和NSE的检测可分别很好地反映星形胶质细胞和神经元的数量及功能状态,成为在朊病毒病发病过程中重要的病理变化指标。
- 陈岚张瑾肖新莉韩俊高建梅张宝云许彩民董小平
- 关键词：朊病毒病仓鼠神经元
