国家自然科学基金(31201883)
- 作品数：4 被引量：10H指数：2
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- GP5^(Δ84-119)稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响被引量：3
- 2016年
- 为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白GP5的第二胞外区在病毒复制中的作用及机制,利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84—119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPBGP5Δ84-119),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,筛选稳定表达GP5Δ84-119的Marc-145细胞系,并利用cck-8试剂盒检测细胞的增殖情况;用PRRSV SD16株感染筛选的细胞,通过病毒基因拷贝数和病毒滴度检测GP5Δ84-119表达对PRRSV复制影响;通过Real-time PCR和ELISA检测病毒感染前后细胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ的表达情况。经RT-PCR、Western blot和IFA检测,GP5Δ84-119在Marc-145细胞中获得稳定表达,将此细胞命名为Marc-145-GP5Δ84-119;细胞增殖曲线显示GP5Δ84-119的表达不影响细胞的增殖;对病毒基因拷贝数和病毒滴度检测发现GP5Δ84-119的表达可以抑制PRRSV的复制,这种抑制作用可能是通过上调IFN特别是IFN-β的表达而实现的。研究表明GP5第二胞外区在PRRSV复制中发挥重要作用。
- 王晓红宋林林李亮亮袁传奇姜博周恩民穆杨
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒干扰素
- GP5△84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响
- 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and res...
- 王晓红宋林林李亮亮袁传奇姜博周恩民穆杨
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒干扰素
- 关中黑猪IL-5 cDNA的克隆表达与多克隆抗体制备被引量：1
- 2013年
- 目的克隆关中黑猪IL-5 cDNA,构建该基因的不同表达质粒,获得表达的IL-5并制备其多克隆抗体。方法提取佛波酯(PHA)刺激的关中黑猪外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR克隆猪IL-5基因(sIL-5),鉴定后将sIL-5基因分别克隆到pQE30、pET-32a和pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pQE-sIL-5和pET-sIL-5及pEGFP-sIL-5,将pEGFP-sIL-5瞬时转染PK-15细胞,将pQE-sIL-5和pET-sIL-5分别转化JM109和BL21,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot法鉴定表达蛋白后,通过镍柱纯化目的蛋白。用纯化的BL21表达的IL-5免疫小鼠,制备其多克隆抗体,用纯化的JM109表达的IL-5通过优化的间接ELISA检测抗体效价。结果成功获得关中黑猪的IL-5基因(登录号KC660157),大小405 bp,与GenBank中猪IL-5参考序列同源性99.75%,仅25位的T变成C,但编码的氨基酸完全相同;荧光显微镜观察发现pEGFP-sIL-5在PK-15细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示JM109表达的目的蛋白的相对分子质量(M_r)约15 000,而BL21表达的目的蛋白M_r约30000,Western blot法检测结果表明,表达的目的蛋白均具有良好的反应原性;免疫小鼠后获得了IL-5的多克隆抗体,抗体效价最高可达1:12 800。结论克隆了关中黑猪IL-5基因片段并成功表达,获得了IL-5的多克隆抗体。
- 穆杨刘园园李亮亮刘阳尚川川周恩民
- 关键词：IL-5多克隆抗体
- 干扰和稳定表达GP5对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染早期复制的影响被引量：1
- 2018年
- 为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要结构蛋白GP5对病毒复制的影响及其机制,利用PiggyBac Transposon载体系统构建表达GP5的重组质粒(pPB-GP5),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,获得稳定表达GP5的Marc-145细胞,在确定GP5表达不影响细胞增殖的基础上,用PRRSV感染筛选的细胞,通过N基因拷贝数、N蛋白表达水平和病毒滴度检测确定GP5表达对病毒复制的影响,并采用ELISA方法检测培养上清中IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平;进一步针对PRRSV ORF5编码区设计合成3对特异性siRNA,转染Marc-145细胞6和12h后以0.1 MOI病毒感染细胞,感染后24h收集细胞,采用荧光定量PCR(qPCR)检测GP5mRNA的表达,采用Western blot检测PRRSV N蛋白的表达。结果显示:经RT-PCR、Western blot和IFA检测,确定GP5在Marc-145细胞中获得稳定表达,且不影响细胞增殖,但可以在感染早期促进PRRSV在细胞中的复制,这种促进作用可能是通过下调IFN的表达发挥的;与阴性对照siRNA相比,3对特异性siRNA均能抑制PRRSV复制,其中100nmol·L^(-1)的siRNA GP5-471的抑制效果最好。研究表明GP5在PRRSV复制中发挥着重要作用。
- 宋林林贾存瑜韩熙梦周恩民周恩民
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5小干扰RNA干扰素
- 抗独特型抗体研究进展被引量：5
- 2016年
- 免疫系统是生物体体内执行免疫功能的组织系统,由免疫器官（组织）、免疫细胞和免疫分子组成。机体的免疫功能包括体液免疫和细胞免疫两大部分,两者相互独立又紧密配合,发挥免疫防御、免疫自稳和免疫监视等重要作用。
- 穆杨周恩民
- 关键词：抗独特型抗体体液免疫功能抗原刺激免疫防御免疫监视免疫分子
