国家教育部博士点基金(200806100060)
- 作品数：5 被引量：11H指数：2
- 相关作者：宋跃明刘立岷汪雷龚全袁海峰更多>>
- 相关机构：四川大学华西医院宁夏医科大学更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金宁夏回族自治区自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- NEP1-40基因修饰对神经干细胞移植后存活和分化的影响被引量：5
- 2013年
- 目的探讨NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)基因修饰对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植后存活和分化的影响。方法从孕18 d Wistar大鼠胚胎大脑皮质中分离获得原代NSCs并进行体外培养。采用慢病毒载体将NEP1-40基因导入第3代NSCs内完成NEP1-40基因修饰。将30只成年雌性SD大鼠在T9水平进行脊髓右侧半切后随机分为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)组(B组)、NSCs移植组(C组)、NEP1-40基因修饰NSCs组(D组),每组各10只,伤后7 d在损伤局部分别植入NSCs基础培养基、NSCs悬液及NEP1-40基因修饰的NSCs;另取10只SD大鼠仅行T9椎板切除设为假手术组(A组)。移植后8周,取损伤段脊髓组织行辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)神经示踪、巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色及神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫组织化学染色,评价神经纤维再生情况及移植细胞存活和分化情况。结果移植后8周,A、B、C、D组HRP阳性染色神经纤维束分别为(85.17±6.97)、(12.17±2.79)、(33.58±5.47)、(59.25±7.75)个,B、C、D组显著少于A组(P<0.01);但C、D组显著高于B组,D组显著高于C组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Nestin免疫荧光染色示,A组未见明显Nestin荧光信号,B组仅可见少量散在荧光信号,C、D组有较强荧光信号。免疫组织化学染色定量分析示,NF-200阳性细胞数及MBP积分吸光度(IA)值A组最高,D组次之,C组较少,B组最少,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);GFAP阳性细胞数B组最多,D组次之,C组较少,A组最少,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);C、D组间NF-200、GFAP、MBP阳性细胞百分比比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 NEP1-40基因修饰对NSCs移植后的分化无明显诱导性,但能促进移植细胞存活、分化及神经元轴突再生,为研究NSCs移植治疗SCI提�
- 汪雷宋跃明袁海峰刘立岷龚全孔清泉杨曦
- 关键词：神经干细胞NEP1-40细胞移植细胞分化
- 慢病毒介导NEP1-40转染神经干细胞的研究被引量：2
- 2015年
- 目的通过慢病毒载体将NEP1-40基因转入神经干细胞内表达,探讨NEP1-40基因体外转染大鼠神经干细胞的可行性。方法将大鼠胚胎室管膜区神经干细胞(NSC)采用已成功构建的NEP1-40慢病毒载体转染,同时设立空白慢病毒载体对照组及神经干细胞对照组。用荧光显微镜观察细胞内荧光表达情况,计算转染率,采用RT-PCR及Western blot法检测NEP1-40在细胞内表达情况。结果 NEP1-40基因慢病毒载体转染NSC其感染复数(MOI)为10时,最佳转染率可达96%;转染后NSC中GFP荧光表达24h开始出现,48h达最高分值,并且可以稳定表达。RT-q PCR提示NEP1-40mRNA表达在实验组明显增加,Western blot结果提示NEP1-40及GFP融合蛋白在细胞内稳定表达。结论经慢病毒携带NEP1-40基因成功转染入NSC内,并且可在NSC内稳定表达。
- 袁海峰杨生森胡利红汪雷刘立岷宋跃明
- 关键词：神经干细胞NEP1-40慢病毒载体转导免疫荧光
- NEP1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响被引量：6
- 2014年
- 目的通过与单纯的神经干细胞移植进行比较,探讨NEP1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响。方法从孕18 d的Sprague-Dawley（SD）大鼠胚胎大脑皮质中分离获得原代神经干细胞,体外培养及传代后采用巢蛋白免疫荧光染色进行鉴定。采用已成功构建的慢病毒载体将NEP1-40基因导入第3代神经干细胞内建立NEP1-40基因修饰的神经干细胞。将30只SD大鼠在第9胸椎水平进行脊髓右侧半切后随机分为3组,每组各10只,伤后第7天在损伤局部分别植入细胞培养液（损伤组）、神经干细胞（NSC组）及NEP1-40基因修饰的神经干细胞（NEP1-40-NSC组）。另取10只仅行第8~10胸椎椎板切除,设置为假手术组。细胞移植前和移植后8周通过Basso-Beattle-Bresnahan（BBB）运动功能评分及网格测试评价神经功能恢复情况。结果细胞移植后8周,BBB测试及网格测试结果显示：损伤组大鼠BBB评分最低且网格摔倒次数最多,单纯神经干细胞移植组BBB评分较之增高且网格摔倒次数减少（P〈0.01）,而NEP1-40基因修饰的神经干细胞移植组BBB评分最高且网格摔倒次数最少,和前两组相比差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 NEP1-40基因修饰能进一步提高单纯神经干细胞移植对于大鼠脊髓损伤后行为功能恢复的治疗效果,为研究神经干细胞移植治疗脊髓损伤提供了新的思路和实验依据。
- 汪雷宋跃明刘立岷李涛龚全杨曦
- 关键词：神经干细胞移植脊髓损伤
- 干细胞移植治疗脊髓损伤的研究现状
- 2015年
- 脊髓损伤是目前脊柱外科临床上一种常见的疾病,至今仍是一个治疗难题。目前临床上的治疗手段如药物治疗、手术治疗等的治疗效果均极为有限,大部分患者经常规治疗后并未获得神经功能的实质性进展。干细胞移植后在局部能分化为目标细胞如神经元来发挥相应的功能,是目前脊髓损伤治疗的研究热点,尽管一直尚处于实验研究阶段,但仍然取得了较大的进展,为临床治疗脊髓损伤提供了较为可靠的实验依据。现根据国内外发表的相关文献综述干细胞移植治疗脊髓损伤,以期对干细胞移植的实验研究及临床治疗起到一定的参考作用。
- 汪雷宋跃明
- 关键词：干细胞脊髓损伤
- NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定被引量：2
- 2012年
- 目的构建NEP1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建NEP140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础。
- 袁海峰宋跃明刘浩周春光孔清泉刘立岷龚全
- 关键词：NEP1-40神经再生慢病毒载体293T细胞
