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中国蛇岛蝮蛇毒蛋白的电泳结合串联质谱法分析被引量：4: 2009年; 采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）对中国辽宁蛇岛蝮（Glovdius shedaoensis）蛇毒（GSSV）进行分离，染色结果显示该蛇毒中含有多种相对分子质量为12～85ku的蛋白组分。凝胶上切割的蛋白带经胶内二疏苏糖醇（DTT）还原和碘乙酰胺（IAM）修饰后进行胰蛋白酶水解，所得肽段采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC—nESI MS／MS）进行分析，蛋白鉴定采用Sequest Bioworks软件搜索NCBInr数据库完成。从GSSV中鉴定出超过25种蛋白组分，主要包括：酸性磷脂酶A2、碱性磷脂酶A2、神经生长因子、突触前神经毒素、出血因子、类凝血酶、丝氨酸蛋白酶、糖原合酶、金属蛋白酶、成熟酶、L-氨基酸氧化酶、纤溶酶源激活物、外源凝集素、富含半胱氨酸分泌酶、去整合素、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原凝崮抑制因子A、血管凋亡诱导蛋白1、氨甲酰基磷酸合成酶、吡喃糖-2-氧化酶以及ablomin，catrin，mucrofirase，pallabin，salmosin和triflin的同源蛋白。; 刘淑清张巧巧张操孙明忠李建立吴玉群孙立新; 关键词：蛋白电泳

双向电泳结合质谱初步分析蛇岛蝮蛇毒蛋白质组被引量：5: 2009年; 采用荧光染料(Cy5)标记中国辽宁蛇岛蝮(Gloydius shedaoensis shedaoensis,GSS)蛇毒(snake venom,SV,GSS-SV)蛋白质,获得了该蛇毒的双向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D SDS-PAGE)图谱,经DeCyder软件分析,分辨出1000多个蛋白点,分子量范围在10～150ku间,等电点在4～7的蛋白质点占78.8%。凝胶后染色(post-staining)采用蛋白荧光染料Deep Purple,选取的5个蛋白点经胶内酶解,产生的肽段经高效液相色谱-电喷雾串联质谱(high performance liquid chromatography/HPLC-electro-spray ionization tandem mass spectrometry/ESI-MS/MS,HPLC-ESI-MS/MS)进行序列测定,质谱数据经Sequest Bioworks软件分析,为蛇毒L-氨基酸氧化酶、金属蛋白酶、类凝血酶、纤溶酶原激活物和磷脂酶A2的同源蛋白。本研究采用的荧光标记2DSDS-PAGE结合HPLC-ESI-MS/MS的技术适于高通量研究蛇毒蛋白组成。; 马驰刘淑清宗军卫袁章利孙明忠吴玉群孙立新郑庆印; 关键词：蛇毒双向电泳高效液相色谱电喷雾质谱

中国蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库的构建被引量：2: 2010年; 为研究中国蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensis)基因工程产品,采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术构建其毒腺的cDNA表达文库。采用RNAiso试剂提取毒腺总RNA,再采用Poly(A)PuristTM试剂盒分离纯化mRNA,第一链cDNA经反转录合成,双链cDNA经LD-PCR合成并扩增;分级分离去除小片段,收集大于400 bp的cDNA片段,与质粒载体pDNR-LIB连接,采用电转化法将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞DH10B。构建的蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库库容量为8×107cfu/ml,大多数插入片段大于1 000 bp,重组质粒表达率高(100%)。本研究成功构建了高质量的蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库,表达文库质量高,可用于进一步克隆和表达中国蛇岛蝮蛇蛋白活性组分基因,并对其功能进行研究。; 刘淑清郭春梅侯志杰颜栋孙明忠王立平王小平孙立新; 关键词：CDNA文库 SMART技术 PCR

2D-DIGE-HPLC-nESIMS/MS对2,4-二硝基苯磺酸损伤HaCaT细胞差异蛋白质的鉴定被引量：2: 2011年; 采用Cy2、Cy3和Cy5荧光染料标记蛋白,建立了人角质形成细胞HaCaT受2,4-二硝基苯磺酸(DNBS)刺激前后的双向胶内差异凝胶电泳(2D-DIGE)图谱,每组平行样本数为3。凝胶采用蛋白荧光染料Deep Purple进行后染色(Post-stain)。DeCyder定量分析软件在每块凝胶上平均检测到1 200个以上蛋白斑点,每块胶上都匹配得到的相同蛋白质斑点有846个。其中有7个斑点丰度变化在50%以上,统计学意义显著(P值小于0.05)。利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-nESI MS/MS)成功鉴定5个表达上调的斑点分别为X染色体开放阅读框26(Cxorf26)、人辅分子伴侣23(PTGES3)、钙调蛋白(CALM3)、肌球蛋白轻链6(MYL6)和断裂点丛集区蛋白1(BANF1);2个表达下调蛋白斑点被鉴定为转录延伸因子B肽链2(TCEB2)和核糖体蛋白L23(RPL23)。除MYL6被报道与皮肤疾病相关外,其它蛋白与皮肤病变的关系有待研究。该研究得到的7个差异表达蛋白为DNBS类化学致癌物职业接触者皮肤病变研究提供了有价值的线索。; 孙明忠杨帆侯志杰郭春梅郭一萌刘淑清; 关键词：HACAT

长白山白眉蝮蛇蛇毒酸性PLA_2质谱鉴定及其对血小板聚集的抑制作用被引量：2: 2010年; 通过对纯化得到的长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2(ABUSV-PLA2)进行胶内胰蛋白酶酶解,产生的肽段经高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-nESI-MS/MS)进行序列测定,蛋白鉴定采用SequestBioworks软件完成。ABUSV-PLA2与其它蛇毒来源PLA2的氨基酸序列比对表明:ABUSV-PLA2是一种新的蛇毒酸性磷脂酶A2。以ADP诱导的人血小板聚集实验结果表明:ABUSV-PLA2对ADP诱导的血小板聚集有轻微的解凝效应,但具有显著拮抗血小板的聚集作用,并呈现明显的剂量-效应关系,IC50为356nmol/L。; 袁帅刘淑清付冬雪佟欣孙明忠; 关键词：磷脂酶A2 蛇毒血小板聚集抑制剂

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辽宁省自然科学基金(2008S077)