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国家科技攻关计划(2004BA901A03): 作品数：57 被引量：415H指数：12; 相关作者：程安春汪铭书陈孝跃李雪梅陈希文更多>>; 相关机构：四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室西南民族大学更多>>; 发文基金：国家科技攻关计划四川省重点科学建设项目教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>; 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程更多>>

麻鸭α干扰素基因的克隆与序列分析被引量：10: 2006年; 根据G enB ank文献,应用O ligo 6.0分析软件设计合成了用于扩增鸭Ⅰ型干扰素(-αIFN)基因的2对引物,以麻鸭肝脏提取的基因组DNA为模板,采用N est-PCR方法扩增获得了约600 bp片段,经T载体克隆和测序分析证实,是麻鸭Ⅰ型干扰素基因(SD IFN-α)。生物信息学分析表明,SD IFN-α的开放阅读框架(ORF)由576个核苷酸所组成,预测蛋白质相对分子质量为21 640,编码191个氨基酸,其中前28个氨基酸可能是信号肽部分,切割位点在28号氨基酸A和29号氨基酸S之间,序列中无内含子。成熟的多肽中含8个半胱氨酸和2个糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点(prote in k inase C phosphory lation s ite)和2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(case in k inaseⅡphosphory lation s ite)。SD IFN-α与鸭α-IFN基因核苷酸同源性为99.3%,有4个碱基的差异;与北京鸭α-IFN基因的核苷酸同源性为99.1%,氨基酸同源性为98.96%;与鸡-αIFN的核苷酸同源性为71.8%。与鹅、狗、牛、马和人的-αIFN基因的核苷酸同源性分别为96.0%、45.8%、45.5%、44.6%和41.7%。遗传进化分析结果表明,IFN-α的这些同源性与其动物分类地位相一致。; 陈斌程安春汪铭书余勇唐琼石谦张东彭健康陈海滨; 关键词：麻鸭克隆

鸭IFN-α真核表达质粒基因枪免疫对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭细胞免疫调节作用初探被引量：3: 2007年; 为探索鸭α干扰素(IFN-α)真核表达质粒(pcDNA-SDIFN-α)对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭的细胞免疫调节作用,本研究将pcDNA-SDIFN-α以1、3和6μg/只3个剂量用基因枪轰击法分别免疫28日龄鸭,以PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,所有鸭15 d后接种鸭瘟(DP)弱毒疫苗。接种后第3、7、14、21、28、35、49、63、84天采血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鸭外周血中T淋巴细胞转化效果;第7、14、21、28、35、49天采血用流式细胞仪(FACS)测定CD3+T淋巴细胞数量的动态变化。结果发现:①T淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值),不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭外周血T淋巴细胞转化功能于第3-84天均高于PBS和空载体pcDNA对照组,其中第3-84天1μg/只组极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组;1μg/只组第3-35天显著(P≤0.05)高于3、6μg/只组;3μg/只组于第14-35天高于6μg/只组,但差异不显著(P≥0.05);pcDNA对照组略高于PBS对照组,但差异不显著(P≥0.05);②CD3+T淋巴细胞数量变化,不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭于第7-49天均高于PBS和pcDNA对照组,其中1μg/只组于第14-49天极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组于第21-49天极显著(P≤0.01)高于PBS对照组和显著(P≤0.05)高于pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组;1、3和6μg/只组之间差异不显著(P≥0.05);pcDNA组于第14-49天高于PBS组,但差异不显著(P≥0.05)。研究表明,pcDNA-SDIFN-α提前15 d免疫能显著增强DP弱毒疫苗诱导的鸭细胞免疫力,以基因枪免疫1μg/只的效果最佳,它是一种良好的增强DP弱毒疫苗细胞免疫的分子佐剂。; 程志萍程安春汪铭书陈斌刘闯段坤周雪陈孝跃; 关键词：基因枪鸭瘟弱毒疫苗细胞免疫分子佐剂

沙门菌外膜蛋白的免疫学研究进展: 2008年; 张振华程安春汪铭书; 关键词：免疫学技术外膜蛋白沙门菌机体免疫系统基因检测 OMP

鸭瘟病毒强毒株在感染鸭实质器官内的增殖与分布被引量：9: 2008年; 鸭瘟病毒(DPV)CHv强毒株经皮下注射、滴鼻和口服3种途径分别感染20日龄天府肉鸭,于攻毒后10、30、60、90min以及4、12、48、72h和9、15d每组分别剖杀2只鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊、哈德氏腺等实质器官,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV在这些器官的分布和增殖进行检测。结果表明,DPV分布到具体器官的速度与感染的途径、鸭的解剖结构密切相关,其中皮下注射是DPV分布到各实质器官速度最快的途径。30min于皮下感染鸭的肝、脾、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、肺、脑、肾,口服感染鸭的肺和法氏囊,滴鼻感染鸭的心脏和哈德氏腺均检测到DPV-DNA;90min所有受检样品中检测到DPV-DNA。鸭抗DPV感染的免疫器官的重要性依次是脾、胸腺、法氏囊和哈德氏腺,30min内DPV-DNA分布到脾、胸腺、法氏囊的速度和数量决定了DPV感染的潜伏期和疾病的严重程度。不同途经感染鸭的相同器官在同一时间内的DPV-DNA拷贝数大多以皮下感染鸭为最高。DPV致死鸭的法氏囊和肾是DPV-DNA含量最高的实质器官。; 杨晓燕程安春汪铭书齐雪峰郭宇飞葛忠源黄永成张素辉胡骑于波周登春陈孝跃; 关键词：实时荧光定量PCR

我国部分地区规模化鸭场鸭源致病性沙门氏菌的药物敏感性检测及耐药性分析: 采用WHO推荐的Kirby-Bauer法对我国16个地区规模化鸭场1999-2005年间感染沙门氏菌的患病和死亡鸭所分离到的175株鸭源致病性沙门氏菌进行了药敏试验。结果表明,菌株对37种抗菌药物的药敏结果令人吃惊,耐药...; 钟传德程安春汪铭书李玲段泽于小娜仲崇岳陈孝跃; 关键词：规模化鸭场致病性沙门氏菌耐药性; 文献传递

间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立被引量：8: 2008年; 【目的】建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDVIgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为:切片在0.01mol·L-1柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修复20min后,以10%马血清37℃下封闭30min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈"334"分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。; 张舍郁程安春汪铭书沈婵娟李传峰; 关键词：间接免疫荧光抗原定位

沙门菌质粒的研究进展被引量：1: 2008年; 曹平汪铭书程安春邓树轩; 关键词：沙门菌质粒 DNA分子人畜共患病血清型

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用被引量：9: 2007年; 根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果。; 程安春于小娜汪铭书朱德康李玲孙磊陈孝跃; 关键词：PILA基因原核表达

FQ-PCR检测DPV强毒皮下注射对鸭呼吸道双歧杆菌、芽孢杆菌和肠球菌数量的影响: 根据本实验室建立的检测双歧杆菌、芽孢杆菌及肠球菌的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法, 对20日龄樱桃谷鸭经皮下注射途径感染鸭瘟病毒CH强毒株后的呼吸道内双歧杆菌、芽孢杆菌及肠球菌的数量变化规律进行了研究。结果表明,...; 张素辉程安春汪铭书杨晓燕齐雪峰黄永成葛忠源胡骑陈孝跃; 关键词：FQ-PCR 双歧杆菌芽孢杆菌 DPV 呼吸道; 文献传递

基于TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV强毒不同途径感染鸭实质器官增殖分布规律研究: 鸭瘟病毒(DPV)CHv强毒株经皮下注射、滴鼻和口服三种途径分别感染20日龄天府肉鸭, 于10、30、60、90min以及4h、12h、48h、72h、9d、15d分别剖杀两只鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊...; 杨晓燕程安春汪铭书齐雪峰郭宇飞葛忠源黄永成张素辉胡骑于波周登春陈孝跃; 关键词：TAQMAN-MGB探针实时荧光定量PCR; 文献传递

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