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BCR-ABL融合蛋白融合区B细胞表位预测: 2006年; 以BCR-ABL融合蛋白氨基酸序列为基础,采用EMBOSS软件及DNAstar软件结合Hopp and Woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案对慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合蛋白(p210^(BCR-ABL))融合区的B细胞表位进行预测。结果表明:BCR-ABL蛋白融合区位于B细胞表位内,该表位含有α-螺旋和无规则卷曲结构。BCR-ABL融合蛋白融合区B细胞表位预测的研究对应用合成肽抗原制备融合区单克隆抗体具有重要的指导意义。; 张保平龚卫娟潘兴元季明春; 关键词：慢性粒细胞白血病 BCR-ABL融合蛋白 B细胞表位

双表达外源性4-1BBL/RANTES的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究: 2007年; 目的探讨K562细胞表达外源性蛋白4-1BBL/RANTES后,对T细胞、NK细胞有无活化作用,为进一步构建人工抗原提呈细胞提供前提。方法采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和RANTES基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-RANTES。经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、RANTES分子的K562细胞(K562/4-1BBL/RANTES)。经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/RANTES细胞用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达;对NK细胞同时检测了活化性受体NKG2D的表达情况。结果受K562/4-1BBL/RANTES细胞刺激后,CD3+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK细胞的活化性受体CD69的表达与未受刺激前相比,均有明显上调;但与单纯K562细胞刺激组相比,无显著差异。另外,CD8+T细胞CD69的表达及NK细胞NKG2D的表达无明显变化。结论将4-1BBL和RANTES共表达于K562细胞,不具备活化淋巴细胞的效应。; 王丽珩张俊钱莉曹正峰龚卫娟季明春; 关键词：4-1BBL RANTES K562 活化

可溶性HLA-A2-IgGFc融合蛋白在昆虫细胞的表达及鉴定: 2009年; 目的利用杆状病毒-昆虫细胞表达体系制备可溶性HLA-A2与免疫球蛋白IgGFc段的融合蛋白。方法首先将可溶性HLA-A*0201和IgG3分子Fc段的cDNA基因插入杆状病毒表达载体pFastHTa,形成重组载体pFHT-sHLA-A*0201-IgGFc。将该重组载体转化DH10Bac大肠杆菌,sHLA-A*0201-IgGFc基因同源重组入菌体内杆粒(Bacmid)中。抽提阳性杆粒,转染昆虫细胞Sf9,72 h收集病毒上清。再将病毒上清感染Sf9细胞,96 h收集细胞并裂解,SDS-PAGE观察其表达。细胞裂解液经Ni+-NTA树脂纯化Western-blot法鉴定其蛋白质序列,间接ELISA法鉴定是否形成正确构象。结果融合蛋白不仅与HLAⅠ类分子的构象特异性抗体(W6/32)结合,还与羊抗人IgG抗体结合。结论所制备可溶性HLA-A2-IgGFc融合蛋白序列正确,并在体外形成正确空间构象。; 王丽珩龚卫娟肖炜明丁岩冰田芳季明春; 关键词：融合蛋白

p210^(bcr-abl)抗原的T细胞表位鉴定及其特异性CTL细胞检测被引量：1: 2009年; 目的:探讨p210bcr-abl抗原的免疫原性,预测并鉴定该蛋白来源的HLA-A2限制性T细胞表位,并在慢性粒细胞白血病患者中检测其特异性CTL细胞分布。方法:首先利用生物信息学软件预测并选取2个p210bcr-abl来源的表位:BCR-ABL642与BCR-ABL926m;T2细胞亲和力实验鉴定短肽与HLA-A2分子的亲和力;然后制备分别锚合这2种表位的可溶性HLA-A2四聚体,流式检测术检测其特异性CTL细胞在CML患者外周血CD8+T细胞中的频率。结果:与健康人群相比,BCR-ABL642和BCR-ABL926m肽表位限制性CTL细胞的频率在CML患者均明显升高(P<0.01);而来自流感病毒短肽的特异性CTL细胞在两个群体中无统计学差异(P>0.05);另外,BCR-ABL642特异性CTL细胞的频率在CML慢性期和急变期之间有统计学差异(P<0.05)。结论:所选2种肽表位均具有免疫原性,可建立基于这2种短肽的免疫治疗措施。; 张俊王丽珩龚卫娟钱亚云姜扬文季明春; 关键词：CTL 慢性粒细胞白血病

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立被引量：5: 2006年; 目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。; 张俊钱亚云龚卫娟胡茂志季明春; 关键词：流式细胞仪 NK细胞细胞毒性

人免疫球蛋白受体FcγRIIa的基因克隆及在K562细胞的表达被引量：1: 2006年; 目的将外源人免疫球蛋白IgGFc段Ⅱ型受体CD32a分子表达于K562细胞表面,为构建人工抗原递呈细胞提供重要前提。方法自U937细胞RT-PCR得到CD32a的cDNA基因,与T载体连接后亚克隆入表达载体pcDNA3.1(+)。经测序后利用脂质体介导的转染将CD32a分子表达在K562细胞的表面。结果构建的T载体测序后,Genebank比对证实为CD32a的cDNA分子,免疫荧光和流式细胞仪结果均说明CD32a分子在K562细胞得到表达(96.9%)。结论获得的人工构建的表达人免疫球蛋白IgGFc受体的K562细胞,完成人工抗原递呈细胞制备的首要步骤。; 田芳刘丹胡茂志龚卫娟季明春; 关键词：K562细胞

双表达外源性4-1BBL/IL-15的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究被引量：1: 2007年; 为肿瘤过继免疫治疗开发体外激活T细胞、NK细胞的高效途径,研究双表达外源性4-1BBL和IL-15的K562细胞刺激外周血淋巴细胞活化的能力。采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和IL-15基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-IL-15。经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、IL-15分子的K562细胞(K562/4-1BBL/IL-15)。经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/IL15细胞和K562细胞分别用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24 h,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达。对NK细胞不仅同时检测活化性受体NKG2D的表达,还用乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞受不同刺激细胞作用后,细胞毒活性的变化。结果显示受K562/4-1BBL/IL15细胞刺激后,T细胞CD69的表达无明显变化。γδT细胞CD69表达增长5倍。NK细胞CD69表达增长6倍,而NKG2D的表达增加1.5倍;NK细胞受K562/4-1BBL/IL15细胞作用72 h后,细胞毒活性明显提高。提示双表达4-1BBL/IL-15的K562细胞能够高效激活γδT细胞及NK细胞,有望用于肿瘤的过继免疫治疗。; 曹正锋万兵王丽珩刘丹龚卫娟季明春; 关键词：4-1BBL IL-15 K562 活化

放疗对食管癌患者血清可溶性MI CA含量及外周血NK细胞功能的影响被引量：1: 2009年; 目的探讨经不同剂量高能X线照射后食管癌患者血清可溶性MHC—I类分子链相关基因A（sMI-CA）含量、自然杀伤细胞（NK细胞）表面NK细胞2族成员D（NKG2D）受体的表达及其杀伤毒性的变化。方法采用ELISA法检测中晚期食管癌患者（n=28）和正常对照（n=21）血清sMICA的含量，并动态分析6例食管癌患者经不同剂量高能X线照射后血清sMICA含量的变化。采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达，胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化。结果与正常对照相比，食管癌患者血清sMICA含量明显升高，但不同放疗剂量对食管癌患者血清sMICA含量无显著影响。食管癌患者外周血阳性表达NKG2D的NK细胞比例与正常对照相比显著降低，同时其细胞毒活性亦明显降低。而且与治疗前相比，40～60Gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加，同时其NK细胞毒活性最强。结论放疗对食管癌患者血清sMICA含量无明显影响，但适量放疗可使NK细胞毒活性增强。; 刘晓静龚卫娟龚春香范敏其黄普文; 关键词：自然杀伤细胞

高能X线照射对肿瘤细胞表达MICA及NK细胞功能的影响被引量：1: 2009年; 目的探讨肿瘤细胞接受不同剂量高能X线照射后,细胞表面MICA抗原表达及对NK细胞功能的影响。方法分别取T淋巴细胞株T2、结肠腺癌细胞株LS-174-T及食管鳞癌细胞株ECA-109,经0、4、8、163、2 Gy的剂量照射,16 h过夜培养,给细胞标记MICA的单克隆抗体,分析肿瘤细胞平均荧光密度(MFI的变化。并将外周血单个核细胞与经优化剂量照射的肿瘤细胞按10∶1比例孵育,4 h后利用流式细胞术胞内染色法分析NK细胞释放穿孔素的情况以评价NK细胞的杀伤毒性。结果不同肿瘤细胞株上调MICA表达的最佳放疗剂量不同,而肿瘤细胞上调MICA表达后可增强NK细胞的杀伤毒性。结论适宜的放射剂量促进肿瘤细胞表达MICA抗原而增强机体免疫功能。; 刘晓静龚春香范敏其龚卫娟黄普文; 关键词：放疗肿瘤 MICA NK细胞

人工抗原提呈细胞用于肿瘤免疫治疗的研究进展被引量：2: 2006年; 人工抗原提呈细胞的制备原理是模拟T细胞活化的双重信号机制,在一定的载体表面展现抗原肽-MHC分子复合物及共刺激分子、黏附分子的配体或抗体构建而成。它能有效活化和扩增抗原特异性T细胞,而且效率高、可行性好。人工抗原提呈细胞不仅对肿瘤的免疫治疗具有重要价值,而且还可用于抗原表位的筛选、效应细胞的检测及T细胞活化信号的研究。本文就人工抗原提呈细胞的研究进展作一综述。; 王丽珩龚卫娟; 关键词：抗原呈递细胞 T淋巴细胞细胞毒性肿瘤免疫疗法

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江苏省高校自然科学研究项目(04KJB320162)

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