浙江省自然科学基金(Y2110112)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
- 相关作者：黄晓燕林素杨德业王良国戴晓春更多>>
- 相关机构：温州医学院附属第一医院杭州师范大学临床医学院附属医院温州医科大学更多>>
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- 转录因子Pax-8基因干扰后线粒体功能对心肌细胞凋亡的影响被引量：2
- 2013年
- 目的采用RNA干扰技术选择性下调大鼠心肌细胞中转录因子Pax-8的表达，引起线粒体功能的变化，借此探讨线粒体对心肌细胞凋亡的影响。方法将H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌细胞分为3组：实验组[针对Pax-8基因的小干扰RNA（Pax-8siRNA）组]，阴性对照组[非特异性siRNA（NCsiRNA）组]和空白对照组（BCsiRNA组）。荧光分光光度法检测半胱天冬酶（caspase-3）活性以反映细胞凋亡，RT—PCR测定B细胞淋巴瘤／白血病-2（Bcelllymphoma／lewkmia-2，Bcl2）和其同源类似物Bax的mRNA表达，Westernblot测定Bcl2、Bax和胞浆细胞色素C（Cyto）的蛋白表达，流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位（△咿m，用JC-1单体／聚合物比值来衡量线粒体去极化的比例，比值越大，△ψm越低）。结果Pax-8siRNA组心肌细胞caspase-3活性（0．167±0．012）明显高于NCsiRNA组（0．075±0．021）和BCsiRNA组（0．072±0．019），P均〈0．05。Pax-8siRNA组Bcl，mRNA和蛋白的表达水平（分别为0．61±0．06和0．94±0．11）明显低于NCsiRNA组（分别为0．90±0．070和1．39±0．15）和BCsiRNA组（分别为0．94±0．09和1．49±0．20），P均〈0．05。Pax-8siRNA组BaxmRNA和蛋白表达水平（分别为1．05±0．10和1．25±0．12）明显高于NCsiRNA组（分别为0．72±0．03和0．99±0．12）和BCsiRNA组（分别为0．64±0．03和0．92±0．06），P均〈0．05。Pax-8siRNA组心肌细胞线粒体释放Cyto至胞浆的量（0．75±0．14）明显高于NCsiRNA组（0．51±0．06）和BCsiRNA组（0．48±0．07），P均〈0．05。Pax-8siRNA组JC-1单体／聚合物比值（0．163±0．011）明显高于NCsiRNA组（0．092±0．015）和BCsiRNA组（0．072±0．025），P均〈0．05，提示Aqtm明显低于NCsiRNA组和BCsiRNA组（P均〈0．05）。NCsiRNA组与BCsiRNA组上述指标比较，差异均无统计学意义。结论Pax-8基因干扰心肌细胞，促进了心肌细胞的凋亡，线粒体参与了心肌�
- 戴晓春周希黄晓燕王良国林素杨德业
- 关键词：肌细胞细胞凋亡线粒体转录因子
- FGF6基因高表达对鼠心肌细胞凋亡和增殖的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:克隆小鼠成纤维细胞生长因子6(FGF6)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带FGF6基因的重组真核表达载体,并将重组质粒转染至心肌细胞系H9C2细胞中进行表达,测定转染后FGF6基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法:从小鼠心脏组织提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒PIRES2-DsRed2。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体PIRES2-DsRed2-FGF6用脂质体包裹转染大鼠心肌细胞(H9C2),分组:空白对照(BC)组、转染空质粒(NC)组、转染重组FGF6-PIRES2-DsRed2质粒(P-FGF6)组,RT-PCR法检测转染后FGF6 mRNA表达水平,荧光显微镜观察转染效率。Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测转染后细胞的增殖能力;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行FGF6质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blot方法检测活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达。结果:成功克隆了小鼠FGF6基因cDNA,重组真核表达载体PIRES2-DsRed2-FGF6构建成功,且证实转染后大鼠心肌细胞的FGF6mRNA表达明显高于BC组(P<0.05)及NC组(P<0.05),转染FGF6基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),FGF6基因能明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.05),同时下调活化caspase-3表达(P<0.05)。结论:成功克隆了FGF6基因,并构建了真核表达载体PIRES2-DsRed2-FGF6,重组FGF6真核表达载体能够在H9C2细胞中获得有效过表达,并证实FGF6基因可促进心肌细胞的增殖及保护心肌细胞的凋亡。
- 林素黄晓燕王本极潘嘉林王良国杨德业
- 关键词：真核表达载体基因肌细胞心脏
- NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建
- 2013年
- 目的 :克隆小鼠孤儿核受体(NR4A1)基因全长cDNA的读码框,构建携带NR4A1基因的重组真核表达载体,为研究其在心肌细胞中的功能做准备。方法:从Pax-8敲除的小鼠心肌组织中提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,利用逆转录PCR法扩增,将目的产物与pGEM-T Easy载体连接,测序分析正确后,再以相同PCR方法扩增,将其与真核表达载体pIERS2-ZsGreen1连接,构建重组质粒。经限制性酶切及测序鉴定后,利用Lipofectamine2000将重组载体pIERS2-ZsGreen1-NR4A1转染到H9C2心肌细胞。实验分三组:①实验组(PZ-NR4A1组):细胞转染1.2μg pIERS2-ZsGreen1-NR4A1重组载体;②阴性对照组(NC组):细胞转染1.2μg pIERS2-ZsGreen1空载体;③空白对照组(BC组):给予的常规培养液,未做其他处理。并用RT-PCR法和Western blotting法检测转染后NR4A1 mRNA和蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表达载体。转染重组载体到细胞后,相比BC组(1.00±0.00)和NC组(0.99±0.16),PZ-NR4A1组(2.62±0.21)NR4A1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05),而BC组和NC组mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。PZ-NR4A1组(0.72±0.11)NR4A1蛋白的表达量与BC组(0.17±0.07)和NC组(0.21±0.08)相比,PZ-NR4A1组蛋白表达量明显升高(P<0.05),而BC组和NC组蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论:通过基因重组技术,成功克隆了NR4A1基因,并构建了真核表达载体pIERS2-ZsGreen1-NR4A1,且能够在H9C2心肌细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨NR4A1基因的生物学功能及机制奠定了基础。
- 王良国黄晓燕林素潘嘉林戴晓春王本极吴漪浩杨德业
- 关键词：真核表达载体心肌细胞基因克隆
- ALK-3、Pax-8基因抑制后大鼠心肌细胞中Smad1/5/8的表达
- 2014年
- 目的:抑制大鼠胚胎心肌细胞株中ALK-3、Pax-8基因的表达后,探索Smad1/5/8在其中所起的作用。方法:将H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞分为4组:针对Pax-8基因的小干扰RNA(Pax-8 siRNA)组、ALK-3基因的小干扰RNA(ALK-3 siRNA)组、阴性对照(NC siRNA)组和空白对照组。前3组分别给予相应siRNA(5.0μL)和Lipofectamine 2000(5.0μL)配制成的siRNA-脂质体复合物溶液,空白对照组给予等量的细胞培养基。采用qRT-PCR测定Pax-8和ALK-3的mRNA表达,Western blot法检测磷酸化Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)和半胱天冬酶(Caspase)-3表达。结果:与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8 siRNA组的Pax-8 mRNA表达分别下调50%(P<0.05)和54%(P<0.05),ALK-3 siRNA组的ALK-3 mRNA表达分别下调49%(P<0.05)和53%(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。与NC siRNA组和空白对照组比较,ALK-3 siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量分别下调58%(P<0.05)和55%(P<0.05),Pax-8 siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量差异无统计意义(P>0.05)。NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8 siRNA组Caspase-3蛋白表达量分别上调76%(P<0.05)和81%(P<0.05),ALK-3 siRNA组Caspase-3的蛋白表达量分别上调135%(P<0.05)和140%(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。结论:在大鼠胚胎心肌细胞株中对基因ALK-3、Pax-8干扰后能引起细胞凋亡蛋白Caspase-3明显增多,并且在ALK-3 siRNA组发现Smad1/5/8蛋白磷酸化减少,而Pax-8 siRNA组中未发现Smad1/5/8磷酸化减少,提示Smad1/5/8在基因ALK-3被干扰后引起细胞凋亡蛋白Caspase-3增多中起重要作用。
- 陈德准吴漪皓陆圣月林素黄晓燕杨德业
- 关键词：SMAD1磷酸化先天性心脏病
