天津市自然科学基金(12JCZDJC23000)
- 作品数：4 被引量：14H指数：2
- 相关作者：王华忠张微孙鸿卫晓静裴丹更多>>
- 相关机构：天津师范大学南京农业大学更多>>
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- 小麦重要自噬相关基因ATG18的鉴定和表达分析被引量：6
- 2014年
- 【目的】克隆小麦重要自噬相关基因ATG18,分析其编码产物的序列特征和高级结构,了解其在生物、非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式,阐明其生物学功能。【方法】利用EST拼接和RT-PCR方法从白粉菌侵染的小麦叶片中克隆ATG18 cDNA序列,利用生物信息学方法进行基因的外显子-内含子结构分析、编码蛋白的结构域和保守氨基酸预测、高级结构分析和物种间同源蛋白的进化分析。采用实时荧光定量PCR方法研究基因表达对白粉菌侵染和外源激素处理的响应模式及对高盐、干旱、低温黑暗和缺氮培养等逆境胁迫处理的响应模式。【结果】获得了4个小麦ATG18家族成员(TaATG18a、TaATG18b、TaATG18c和TaATG18d)cDNA。4个基因高度相似,均含有1 158 bp开放阅读框(ORF),编码385个氨基酸的蛋白质。4个基因的编码蛋白在一级结构上均含有典型的WD-40结构域、磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)结合基序和保守的ATG2结合位点氨基酸残基。4个基因均具有2种转录后的可变剪接方式,2种剪接产物mRNA分别编码完整的有功能蛋白和N端截短导致结构域和功能位点缺失的无功能蛋白。TaATG18a蛋白在高级结构上折叠成与其他WD-40蛋白类似的β-推进器样构象,PI3P结合基序位于推进器第五叶片的折叠4和第五、六叶片的连接部分,ATG2结合位点位于连接第二叶片和第三叶片的loop上。TaATG18s能够被白粉菌侵染诱导表达,但具体的诱导表达模式在抗、感白粉病反应之间存在明显差异。在广谱抗白粉病基因Pm21和小种专一性抗白粉病基因Pm3f介导的抗病反应中,TaATG18s均呈现接种白粉菌后0—36 h期间的2次诱导表达模式,2次诱导表达时间与白粉菌侵染进程密切相关。在中感材料扬麦158遗传背景上的感病反应中,TaATG18s尽管也呈现2次诱导表达,但第一次诱导表达持续时间短且强度低于含Pm21的近等基因系上抗病反应中的表现
- 孙鸿张微卫晓静王华忠
- 关键词：小麦细胞自噬白粉病
- 小麦自噬相关基因ATG4和ATG8的原核表达及蛋白纯化被引量：1
- 2014年
- 细胞自噬与植物生长、发育和逆境响应等过程密切相关。本研究构建了小麦重要自噬相关基因TaATG4a和TaATG8h的原核表达载体并导入大肠杆菌。IPTG诱导表达后的蛋白质SDS-PAGE电泳结果表明,两个基因在大肠杆菌中均能够高效表达,表达重组蛋白的分子量与预测分子量基本一致。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白,为今后的体外酶活分析、抗体制备和Western杂交等研究奠定了基础。
- 张微孙红裴丹王华忠
- 关键词：细胞自噬小麦原核表达
- 小麦叶肉细胞原生质体制备参数解析及在基因瞬时表达上的应用被引量：6
- 2015年
- 为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程,以小麦幼苗叶片为材料,采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现,酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露醇浓度、纤维素酶浓度、酶解时间和离析酶浓度;甘露醇浓度和纤维素酶浓度对原生质体产量的增长表现相互促进模式,延长酶解时间情况下低纤维素酶浓度产出的原生质体较高纤维素酶浓度破碎情况少,峰值过后的产量下降慢。研究还发现取材幼苗苗龄、光照条件和取材叶位等因素对原生质体产量也有影响。综合以上结果确定了一套优化的参数组合:以黑暗培养条件下的10 d苗龄小麦幼苗第2片真叶为材料,酶解液中的纤维素酶浓度为0.5%、离析酶浓度为0.6%、甘露醇浓度为0.5 mol/L,酶解时间为6 h,使用此参数组合制备的原生质体形状均一、破碎情况轻,产量可达(7.28±2.18)×106个/g,有活性原生质体的比例可达(95.06±2.66)%。采用PEG-Ca^(2+)介导的方法将目标基因导入制备的原生质体,结果表明GFP基因的转化效率可达(61.31±5.74)%,小麦基因Ta ATG8h和异源植物拟南芥基因At PIP2;1的蛋白质产物均定位于正确的亚细胞结构处。
- 杜晓敏王均安子玄裴丹王华忠
- 关键词：小麦原生质体基因转化
- 小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达被引量：2
- 2014年
- 细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制,在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法,从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦1587中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析,以及酵母功能互补实验结果证实,这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达,因此推测,小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控,其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显,说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦—白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现,抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。
- 张微孙鸿邢莉萍卫晓静王华忠
- 关键词：小麦自噬相关基因白粉病
