国家自然科学基金(30972123)
- 作品数：7 被引量：15H指数：2
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- PCR方法构建重组质粒
- 与酶切-连接构建重组质粒方法不同,本文建立了一种不通过限制性内切酶酶切的重组质粒构建方法—一二步PCR。第一步常规PCR,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引...
- 韩来闯马闪闪刘亚娟刘猛刘亮伟
- 文献传递
- 自我延伸过程对木聚糖酶-CBM融合基因的影响
- 2013年
- 探讨了木聚糖酶-纤维素结构结合结构域(CBM)基因融合过程,在不加引物而只用两种DNA片段经PCR扩增全长融合基因,从而证明了自我延伸过程的存在,是指互补匹配的两段DNA互为引物、互为模板在聚合酶作用下合成融合基因的过程,从理论上阐明了PCR中的自我延伸过程。在传统PCR中加入3次循环的自我延伸程序(94℃×1 min,52℃×1 min,72℃×1 min),融合基因扩增量要更多。进而探讨自我延伸程序中延伸时间的影响,发现延伸时间2、3、5 min扩增的融合基因量显著增强;而延伸时间为1 min时,融合基因条带的亮度增加不明显,说明延伸时间是增加扩增量的关键因素。
- 闫鹏飞马闪闪赵黎胡瑜刘亮伟
- 关键词：融合PCR融合基因
- 含正确木聚糖酶基因转化子的活性筛选被引量：1
- 2010年
- 为有效地筛选到带有正确基因的转化子,探讨了活性筛选方法。将木聚糖酶基因与pET20b重组,转化BL21(DE3)大肠杆菌,选取转化子,放入0.5mLLB培养基过夜培养,补加9.5mL培养基2.5h后诱导,收集并冻融裂解细胞,检测酶活性。通过对10个转化子的筛选,其中7个转化子酶活性接近或高于阳性对照菌落,认定为阳性转化子,经DNA测序证明基因序列正确。这个过程只要2～3天,具有快速简便特点。与以往筛选方法中针对转化子中的基因不同,作者直接检测转化子酶活性,筛掉不能表达活性酶的突变基因;其次,用冻融裂解细胞方法简化裂解过程,便于自动化高通量操作;最后,通过比较初筛酶活性,可以筛选高酶活转化子。
- 刘亮伟李运峰郭晓丹
- 关键词：转化子活性检测木聚糖酶
- F/10木聚糖酶二级结构含量对热稳定性的影响被引量：5
- 2013年
- 从PDB库中收集F/10家族12个木聚糖酶晶体结构,查找对应酶最适温度并作为热稳定性指标,分析了二级结构含量与稳定性的关系.结果表明,稳定性与α-螺旋含量明显正相关(相关系数为3.1);与β-折叠片含量负相关,但是相关性很小(相关系数0.2);与无规则片断含量明显负相关(相关系数为-2.2).说明二级结构含量影响酶稳定性,这个结果与(β/α)8结构相吻合,螺旋位于酶分子外周,构成分子骨架;折叠片位于分子中间,构成活性中心区域;无规则片断将螺旋和折叠片连接在一起.这一结果明确解释了前人分子改造结果:螺旋中相关氨基酸突变可以提高酶稳定性,指明了酶分子稳定性改造方向,即:减少结构中无规则片断含量、增加螺旋含量可以提高稳定性.
- 叶延欣闫鹏飞胡渝刘亮伟
- 关键词：木聚糖酶热稳定性
- 合成引物碱基缺失造成木聚糖酶的移码突变
- 2010年
- 黑曲霉木聚糖酶xynⅢ酶分子改造时,常出现引物碱基缺失造成扩增基因移码突变.本研究将xynⅢ克隆入表达载体pET20b,分析移码突变酶C-端氨基酸序列,探讨了该碱基缺失突变的检测方法.引物中缺失1或2 bp碱基时,扩增基因产生2种移码突变酶,分别在正常酶分子C-端增加30或12个氨基酸,比正常酶分子质量分别增加6或2 ku;而缺失3 bp碱基时不产生移码突变,只比正常酶分子少1个氨基酸,含有6个H is标签;通过SDS-PAGE可将移码突变酶与正常酶分子分开,从而将移码突变基因与正常基因分开,这个理论与DNA测序结果完全吻合.同时发现2 bp碱基缺失突变是1 bp碱基缺失突变的2倍,分析了其产生原因.最后,提出了避免引物中碱基缺失移码突变发生的预防措施.
- 刘亮伟卢雪丽胡瑜李运锋
- 关键词：木聚糖酶引物移码突变
- 木聚糖酶碳水化合物结合结构域研究进展被引量：6
- 2010年
- 木聚糖酶含有催化活性结构域,有时还含有非催化活性结构域,促进酶与底物结合,特别是与不溶性底物的结合及降解,称为碳水化合物结合结构域(CBM),它们在木聚糖降解过程中有重要作用。以下从CBM来源,所属家族类型、对不溶性底物结合特性、与底物结合的特定氨基酸、与催化结构域间的连接肽、特别是对影响木聚糖酶稳定性的5个方面进行了综述,说明CBM对木聚糖酶性质有很大影响。自然界中碳水化合物结构复杂、难以降解,所以认识CBM相关性质对研究其与木聚糖酶的协同作用、提高木聚糖酶活性有重要意义,并根据CBM属性用于改造木聚糖酶相关性质进行了展望。
- 刘亮伟程洁陈红歌
- 关键词：木聚糖酶稳定性
- 载体大小对木聚糖酶过量表达的影响被引量：2
- 2010年
- 将黑曲霉Aspergillus niger木聚糖酶基因与表达载体pET21a(5 443 bp)和pET20b(3 716 bp)重组,而后转化E.coliBL21(DE3)细胞,发现大载体细胞和小载体细胞中质粒DNA浓度为(4.6±0.01),(5.5±0.01)g.L-1,木聚糖酶含量为(57.2±10.6),(140.2±22.1)mg.L-1,木聚糖酶酶活性为(6.6±0.2),(69.6±11.2)U.mL-1.相对于大载体细胞,小载体细胞质粒浓度增加19.5%,木聚糖酶含量增加1.45倍,木聚糖酶活性增加9.5倍,说明载体大小对外源蛋白表达的影响效应呈递增趋势.由此可见,小型载体在表达外源蛋白时更利于减少宿主细胞的负担,利于质粒扩增并提高基因拷贝数,最后提高木聚糖酶含量及活性.
- 刘亮伟郭晓丹王宝
- 木聚糖酶抑制蛋白对木聚糖酶应用领域的影响被引量：2
- 2011年
- 木聚糖酶已广泛应用于饲料、食品加工、纸浆漂白等领域,然而近年研究发现在小麦等谷物中存在一种能抑制木聚糖酶活性的蛋白质性质的成分,称为木聚糖酶抑制蛋白。木聚糖酶抑制蛋白具有多型性,但不同类型抑制蛋白都只作用于外源木聚糖酶,而对谷物内源性木聚糖酶没有抑制作用。这就对木聚糖酶应用领域中酶功效的发挥提出了挑战:抑制蛋白的存在是否影响外加木聚糖酶的作用?目前仅在面包焙烤、谷朊粉-淀粉分离和动物饲料等领域有相关的研究,本文即综述木聚糖酶抑制蛋白对这些领域中木聚糖酶功能的影响作用。
- 陈红歌张俊丽刘亮伟贾新成
- 关键词：木聚糖酶动物饲料
