国家高技术研究发展计划(2002AA206653)
- 作品数：11 被引量：11H指数：2
- 相关作者：扈荣良张守峰姚伟张嘉保刘殿峰更多>>
- 相关机构：军事医学科学院吉林大学中国医科大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达被引量：1
- 2007年
- 构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR,以200μg、500μg、1000μg、2000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/ml。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,也就是说蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。
- 周兴张居农
- 关键词：蚓激酶重组逆转录病毒转染
- 蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达被引量：1
- 2007年
- 构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R,以200μg、500μg、1000μg、2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后收集病毒上清感染NIH_3T_3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×10~4CFU/mL。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。
- 周兴张居农
- 关键词：蚓激酶重组逆转录病毒转染
- 蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建及其在牛乳腺中的表达被引量：1
- 2006年
- 将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶牛乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。进而用病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺小叶组织,产后奶样经FAPA法检测表明蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织,并能实现相对稳定的表达。
- 刘殿峰张嘉保张守峰姚伟李雪扈荣良
- 关键词：蚓激酶重组逆转录病毒转染
- 蚓激酶成熟肽的原核表达及纯化
- 2006年
- 应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因,并按相应的阅读框架克隆入表达载体pGEX-4T中谷胱甘肽S-转移酶(GST)的下游。重组质粒转化大肠杆菌Rosetta株,分别在1.0mmol/LIPTG、37℃和0.1mmol/LIPTG、28℃条件下诱导,蚓激酶成熟肽-GST融合蛋白获得了高效表达,且后者得到了可溶性蛋白。经SDS-PAGE证实所表达的融合蛋白产物相对分子量与预期的53kD相符。并且以等电点和亲和层析的方法对表达出的可溶性蛋白进行了纯化。
- 李清竹赵玉军张守峰刘烨寇叙扈荣良
- 关键词：蚓激酶成熟肽原核表达纯化
- 蚓激酶在牛乳腺中的稳定表达
- 2007年
- 目的构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,并在牛乳腺中稳定表达蚓激酶。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中,获得蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418筛选阳性细胞克隆,克隆扩大培养后,病毒上清转染妊娠7个月奶牛乳腺小叶组织。产犊后采奶样,FAPA法检测蚓激酶活性,并进行凝胶薄层扫描分析。结果蚓激酶重组逆转录病毒最高滴度约为1×104CFU/ml。奶牛产后奶样中蚓激酶基因在牛乳腺中可连续表达112d,活性相当于30000英国单位/L牛奶,在牛奶中表达量可达180mg/L牛奶。结论已成功构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,蚓激酶可在牛乳腺中相对稳定地表达。
- 刘殿峰张嘉保张守峰姚伟张锐陈健文力正袁宝扈荣良
- 关键词：蚓激酶逆转录病毒转染
- 蚓激酶基因在山羊乳腺中的瞬时表达被引量：4
- 2005年
- 构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和蚓激酶基因cDNA的乳腺表达载体pβLK.通过直接注射将重组载体DNA导入山羊的乳腺组织,以纤维蛋白平板法测定乳汁中蚓激酶基因表达产物的活性.实验证实蚓激酶基因可以在山羊乳腺中瞬时表达.在进行山羊乳腺的瞬时表达时,适宜的注射剂量为500μg/ml.注射后6～9 h的表达量最高,达到2.0×105U/L,并持续表达至60h.
- 范志强姚汝强张守峰王太一王禄增扈荣良
- 蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK^R的构建及其在山羊乳腺组织中的表达被引量：3
- 2005年
- 目的在山羊奶中表达蚓激酶。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶山羊乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染妊娠期奶山羊乳腺小叶组织,山羊产后采奶纤维蛋白平板溶圈法检测蚓激酶活性。结果产后奶样经纤维蛋白平板溶圈法检测羊奶具有明显纤溶活性。结论蚓激酶基因已经整合到奶山羊乳腺组织并能实现相对稳定的表达。
- 姚伟任文陟张守峰范志强扈荣良涂长春
- 关键词：蚓激酶重组逆转录病毒转染
- 泌乳乳腺作为真核基因的有效表达系统研究
- 2006年
- 目的 探讨泌乳腺组织作为真核基因快速表达系统的可行性。方法 以蚓激酶（LK）作为目的标志基因，分别构建了在泛组织嗜性的巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子、逆转录病毒长末端重复序列（LTR）和组织特异性的beta-酪蛋白启动子调控下的3种真核表达载体pICLK、pLLKSN和pIbLK。制备各重组质粒后，以泌乳期羊乳腺作为支持系统，在处于稳定泌乳阶段分别注射不同量的重组质粒于山羊乳腺组织中。在注射后不同时间采集奶汁，检测纤溶活性。结果蚓激酶的不同重组质粒在注射到乳腺组织之后迅速得到表达，注射后6～9h蚓激酶表达量达到高峰，并可持续至72h以上；不同表达载体间表达量略有变化，但差异无统计学意义。结论 泌乳乳腺组织可以作为真核基因的1种快速有效的表达系统。
- 周雪艳张守峰姚伟任文陟张菲扈荣良
- 关键词：蚓激酶真核基因
- 蚓激酶基因乳腺表达载体构建及在牛乳腺中的瞬时表达
- 2006年
- 在稀有密码子的改造基础上,人工合成了849 bp的蚓激酶F-Ⅲ-1全长cDNA序列,并以其为目的基因,构建了以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pBLK和pLN-bCP-LK.2种质粒分别以200,500,1 000,2 000 μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,以纤维蛋白平板溶圈法（FAPA）检测该基因表达后奶样的纤溶活性.结果表明：注射后3～78 h,奶样有明显纤溶活性,其中6～16 h活性最高.500 μgpBLK质粒与其他3个剂量溶圈直径之间差异显著（P＜0.05）,而其他3个剂量之间差异不显著;pLN-bCP-LK质粒的各剂量溶圈直径之间差异均不显著,且2种质粒的同剂量溶圈直径之间差异也不显著.以上结果表明,改造后的蚓激酶基因可以在泌乳期黑白花奶牛乳腺中实现瞬时表达,以500 μg的注射剂量表达效果最佳.
- 刘殿峰张嘉保张守峰姚伟李雪扈荣良
- 关键词：蚓激酶乳腺稀有密码子
- 一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法
- 2006年
- 目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。
- 范志强扈荣良王太一王禄增姚汝强姚伟
- 关键词：DNA纯化方法显微注射转基因小鼠
