哈尔滨市科技攻关计划项目(2011AA6BN019)
- 作品数：5 被引量：12H指数：2
- 相关作者：柳金雄姜永萍陈化兰田石赵双成更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所甘肃农业大学更多>>
- 发文基金：哈尔滨市科技攻关计划项目国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 表达H5亚型禽流感同义(Consensus)HA蛋白的重组质粒构建及体外表达
- 2012年
- 为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。
- 常晓飞赵双成田石柳金雄王靖飞曾显营胡永浩姜永萍陈化兰
- 关键词：H5亚型禽流感病毒
- 禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定被引量：7
- 2012年
- 为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。采用间接免疫荧光、western blot和血凝试验对所表达的蛋白进行抗原性和生物学活性分析。结果表明,表达重组蛋白分子量约为64 ku;IFA和western blot试验证明重组HA蛋白能够与H5亚型禽流感阳性血清特异结合,具有良好的抗原性;血凝试验和淋巴细胞增殖试验显示重组蛋白具有良好生物学活性。重组蛋白的正确表达为进一步研究HA基因功能活性和制备禽流感HA基因亚单位疫苗奠定了基础。
- 赵双成常晓飞田石柳金雄陈普成田国彬邓国华姜永萍陈化兰
- 关键词：禽流感HA基因杆状病毒
- 不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究被引量：1
- 2014年
- 为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)[GS/GD/96]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)、禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rLH5-1株)以及禽流感DNA疫苗(H5亚型,pH5-GD)的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8μg HA/0.3 mL(肌肉注射)、103PFU/100μL(刺种)、106EID50/100μL(滴鼻、点眼)、15μg/200μL(肌肉注射)等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死、不排毒);在病毒攻击前,灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)、禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rLH5-1株)以及禽流感DNA疫苗(H5亚型,pH5-GD)所诱导的HI抗体平均水平分别为8.75log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。
- 赵双成柳金雄陈普成曾显营葛金英乔传玲田国彬姜永萍陈化兰
- 关键词：禽流感H5N1疫苗保护效力
- 表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建被引量：3
- 2012年
- 为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。
- 焦同路王靖飞赵双成王世达常晓飞田石柳金雄李雁冰姜永萍陈化兰
- 关键词：H5亚型禽流感病毒重组禽痘病毒HA基因
- 禽流感病毒同义NP蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立被引量：2
- 2013年
- 为建立通用型禽流感病毒(AIV)快速检测方法,本研究将合成的同义NP(ConsNP)基因克隆于pET30a中,利用大肠杆菌系统进行原核表达,以纯化重组ConsN P蛋白作为包被抗原,建立了检测AIVNP抗体的间接ConsNP-ELISA方法,并优化了反应条件。结果表明:抗原包被量为1μg/孔;封闭剂为5%脱脂乳;一抗血清稀释度为1∶200;H RP标记的兔抗鸡IgG(酶标二抗)稀释度为1∶20 000;阴阳性临界值为:O D490nm值>0.239。该间接ELISA方法与其他亚型A IV阳性血清均呈阳性反应,与新城疫病毒,马力克病病毒,禽传染性囊病病毒阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性。本研究为进一步研制通用型的禽流感ConsN P-ELISA检测试剂盒奠定了基础。
- 田石邓国华单继艳施建忠张国权陈普成柳金雄文雪霞姜永萍陈化兰
- 关键词：禽流感病毒ELISA
