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北京地区尖锐湿疣患者皮损中人乳头瘤病毒的检测和分型被引量：21: 2002年; 目的分析北京地区尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒的型别和发病特点,比较普通患者和抵抗力弱的患者的发病差异。方法采用PCR和RFLP方法分析HPV型别,对于难以通过酶切鉴定的PCR产物,构建重组测序质粒,检索GenBank进一步分型鉴定。结果普通患者HPV6型为主要感染型别,其次是HPV11型。HPV6型患者年龄较HPV11和HPV6+HPV11型更低;而高龄患者和免疫抑制患者则以HPV11+HPV6的混合感染和HPV11感染为主。部分患者还检测出HPV16和HPV53感染。结论HPV6是尖锐湿疣的主要致病型别,但患者年龄比其他型别更低,而抵抗力弱的患者则多与HPV11的感染有关。一般存在于正常生殖道组织的HPV53也可致尖锐湿疣的发生。; 洪少林王家璧刘跃华司静懿许雪梅郭秀婵曾毅; 关键词：人乳头瘤病毒尖锐湿疣发病特点基因分型

尖锐湿疣病变的人乳头瘤病毒6型L1序列多态性分析被引量：8: 2002年; 采用PCR方法从协和医院尖锐湿疣患者皮损中检测人乳头瘤病毒 (HPV) ,并通过限制性片断长度多态性分析分型发现 ,HPV6型为主要感染型别 ,其次是HPV11型。根据临床特征选择主要致病型HPV6 8个分离株 ,扩增L1晚期基因 ,构建重组测序质粒 ,双脱氧法测序并分析L1区的核苷酸和氨基酸序列变异状况。结果表明 ,HPV6L1基因序列发生碱基替换的区域主要有四个区 ,包括SR1(5 911～ 6 10 4 ) ,SR2 (6 2 17～ 6 2 73) ,SR3(6 5 4 0～6 6 6 1)和SR4 (70 6 2～ 72 5 0 )。少数的碱基替换导致错义突变 ,推导的蛋白质一级结构中有 0～ 3个氨基酸发生变异。; 洪少林王家璧李平川周玲司静懿许雪梅郭秀婵曾毅; 关键词：人乳头瘤病毒6型聚合酶链式反应

用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白被引量：5: 2003年; 目的利用甲醇酵母系统Pichia pastoris高效表达HPV 6型L1蛋白。方法按照Pichiapastoris偏爱密码子合成L1全长基因,构建pPIC3.5K-HPV6-L1表达载体,转化KM71,经组氨酸缺陷的MD培养基和G418筛选,PCR确认L1基因整合,使用BMGY/BMMY培养/诱导目的基因的表达。结果筛选到3株阳性表达克隆,Western blot显示表达产物有部分糖基化现象,使用能识别完整VLP的单抗进行间接免疫荧光检测提示L1蛋白在Pichia细胞内以空间构象形式存在。通过离子交换和亲和层析两步纯化从1L发酵液中得到125μg纯的L1蛋白。结论通过基因优化在甲醇酵母中表达HPV6-L1蛋白,这将为结构与功能研究以及疫苗开发提供条件。; 李平川张晓光周玲曾毅; 关键词：乳头状瘤病毒 HPV 克隆尖锐湿疣

人乳头瘤病毒16L1-减毒志贺氏杆菌为载体疫苗的构建及免疫效应初步鉴定被引量：6: 2005年; 为预防高危型人乳头瘤病毒16型(HPV16)诱发宫颈癌,制备以减毒志贺氏杆菌为载体的HPV16预防疫苗,以期载体可介导机体产生粘膜免疫反应,达到预防HPV16感染的目的。为此构建了以HPV16L1为免疫原的减毒志贺氏杆菌苗,并初步鉴定候选疫苗的减毒特性和免疫效果。利用基于志贺氏杆菌virG/icsA基因的表达载体(pHS3199),将HPV16L1基因插入后构成pHS3199-hpv16L1质粒,电穿孔法将其转入减毒志贺氏杆菌sh42,经筛选获得重组减毒sh42-HPV16L1工程菌。用免疫印迹法检测HPV16L1蛋白表达,连续传代法确定其传代和目的蛋白表达的稳定性;豚鼠角膜巩膜炎症试验检测细菌的毒力和菌苗的免疫效果;小鼠红细胞凝集抑制试验检测免疫血清对病毒样颗粒(VLP)的中和活性。免疫印迹检测证实,重组菌株sh42-HPV16L1可稳定表达HPV16L1;豚鼠角膜巩膜炎症试验证实,该候选菌苗无致病性。减毒sh42-HPV16L1经结膜囊途径免疫豚鼠,可以产生特异性体液免疫应答,免疫动物体内的血清、肠道、阴道分泌物中抗HPV16L1VLPIgG、IgA含量显著高于对照组,并且sh42-HPV16L1免疫动物血清可明显抑制HPV16L1VLP引起的小鼠红细胞凝集。因而sh42-HPV16L1将是一种潜在的HPV16候选预防疫苗。; 杨筱凤陈宏伟郑瑾司履生董小平王一理; 关键词：人乳头瘤病毒16型疫苗子宫颈癌粘膜免疫免疫效应

痢疾杆菌福氏2a sf301 DsbA/virG双突变减毒活候选疫苗构建和初步鉴定被引量：3: 2005年; 为预防细菌性痢疾的爆发和流行,构建志贺氏福氏2a减毒活疫苗。选用中国痢疾杆菌主要流行株sf301为受体菌,通过基因重组交换技术,突变细菌DsbA和virG基因,并以Serney试验和HeLa细胞侵袭实验鉴定突变菌株sf301:△virG:DsbA33G毒力和侵袭力,采用豚鼠结膜囊接种免疫动物,检测突变菌株免疫原性,了解候选疫苗对免疫动物的保护能力。与野生亲本比较sf301:△virG:DsbA33G已完全丧失毒力,但保留了一定的侵袭力。与未接受免疫的对照组相比,通过粘膜途径免疫的豚鼠,无论是单次免疫,还是双次免疫策略都可以诱发血清和胃肠道粘膜部位产生特异性抗sf301LPSIgG和IgA;面部、胃肠道引流淋巴结和脾脏中IgG和IgA抗体分泌细胞(Antibody secretcells ASCs)数目显著性增高;两种免疫方案都可给免疫动物提供100%抵抗野生亲本毒株攻击的能力。初步动物实验结果提示构建的福氏2a活疫苗sf301:△virG:DsbA33G是一种潜在的候选痢疾疫苗。; 杨筱凤周乐郑瑾司履生王一理; 关键词：福氏2A痢疾杆菌减毒活疫苗

利用His-杆状病毒表达系统制备HPV16L1VLP被引量：7: 2005年; 目的　改进现有的昆虫细胞表达和纯化HPV16L1蛋白系统,寻找一种经济、简便、省时的HPV16病毒样颗粒(VLP)疫苗的制备方法。方法　将HPV16L1基因重组入带有 6×His标签的杆状病毒基因组, 并转染昆虫细胞 (Sf 9)进行表达。用镍柱纯化表达蛋白;以小鼠红细胞凝集试验和凝集抑制试验鉴定蛋白生物活性,用透射电镜观察VLP形成。结果　使用新的表达和纯化系统获得HPV16L1高效表达。小鼠红细胞凝集试验和凝集抑制试验证实纯化的HPV16L1蛋白具有HPV16L1的生物学活性;透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结论　带有 6×His短肽的HPV16L1蛋白具有与HPV16L1蛋白同样的生物学活性和自组装成VLP的能力,现时的表达纯化系统,提供了一个省时、省力、简便、经济的制备HPV16VLP疫苗的方法。; 陈宏伟郑瑾杨筱凤王静来宝长司履生王一理; 关键词：蛋白纯化病毒样颗粒

按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达被引量：3: 2004年; Human papillomavirus 6(HPV6) causes a common sexually transmitted disease,the genital warts.L1-capsid protein is a highly promising preventive vaccine that has entered phase Ⅱ clinical trial.But the existing methodologies for producing L1-capsid protein in insect cells is expensive for use in developing countries.In order to get larger amount of L1 protein in E.coli economically,we rebuilt whole L1 gene with preferred codons for yeast P.pastoris,abolished A-T rich regions,subcloned the modified L1 gene (mL1) into pTXB1 and induced expression by IPTG.SDS-PAGE and Western blot showed that mL1-6×His fused proteins could be overexpressed in BL21(DE3).This success will facilitate the HPV vaccine development and structure-function study.; 李平川张晓光周玲曾毅; 关键词：人乳头瘤病毒6型 L1蛋白酵母大肠杆菌

腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配被引量：6: 2006年; 为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究。首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1。将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1。用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达。通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs)。用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs。结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs。; 周玉柏周玲吴小兵曾毅; 关键词：腺病毒人乳头瘤病毒16型密码子优化病毒样颗粒

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国家高技术研究发展计划(2001AA215221)

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