云南省应用基础研究基金(2011FB216)
- 作品数：2 被引量：12H指数：1
- 相关作者：毛小琴贾雄飞张望龙牛华郑瑞更多>>
- 相关机构：成都军区昆明总医院云南省第一人民医院昆明理工大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 蛋白激酶C受体1过表达载体、干扰载体的构建及鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的构建并鉴定蛋白激酶C受体1(RACK1)过表达及干扰真核表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝癌细胞系Huh-7.5.1中扩增RACK1全长cDNA系列,用巢式PCR扩增对应的CDS,并将其克隆到PIRES2-EGFP,PCR鉴定后进行测序分析。以人RACK1基因为靶基因,设计合成两对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,退火后与酶切后的载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen进行连接,并行酶切分析和测序鉴定。将构建好的过表达载体和干扰载体用脂质体转染HUVEC细胞系。结果两对引物PCR扩增的序列大小与预期结果一致,PIRES2-EGFP/RACK1载体954个碱基成功插入到预计位点,序列完全一致。RNA干扰载体pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK插入序列均与预计相符。荧光显微镜观察,转染的HUVEC细胞均表达EGFP和GFP。结论成功构建RACK1过表达载体及其RNA干扰载体,并可被成功导入HUVEC细胞系。
- 张丽贾雄飞牛华郑瑞张望龙毛小琴
- 关键词：RNA干扰
- Caco-2细胞单层模型的建立和评估被引量：11
- 2013年
- 目的建立Caco-2细胞单层的培养和模型评价的方法,为后续研究普萘洛尔(propranolo)对映异构体转运动力学特征奠定基础。方法常规培养条件下,将Caco-2细胞分别以2.5×105、5.5×105cells/ml分别接种于Transwell的聚碳酸脂膜上(0.4ml/well),在培养10d、15d和21d后,以细胞单层跨膜电阻(Transepithelial electrical resistance,TEER)、标志物的表观通透系数(The apparent permeability coefficients,Papp)初步评价Caco-2细胞单层模型的完整性,以扫描电镜和透射电镜验证模型的完整性,以期确定建模时的细胞接种密度和培养时间;检测细胞单层模型在HBSS液和不同浓度的普萘洛尔溶液中培养不同时间时的TEER值,以评价单层模型的稳定性。结果以5.5×105cells/ml接种21d后,TEER>200Ω*cm2、Papp<1.0×10-6cm/s,形态学观察可见细胞融合形成连续、完整的单细胞层,细胞表面覆盖一层刷状缘微绒毛;细胞单层模型在HBSS液和盐酸普萘洛尔药液(≤640mmol/L)中孵育8h后TEER>200Ω*cm2。结论以5.5×105cells/ml为细胞接种密度且培养至21d后,Caco-2细胞单层形态与小肠上皮细胞类似,跨膜电阻、标志物透过量均达到要求,具有良好的完整性,而且细胞单层的完整性在HBSS液和盐酸普萘洛尔药液(≤640mmol/L)中可稳定8h,表明该细胞模型建立成功,可用于后续普萘洛尔对映异构体药物吸收动力学研究。
- 毛小琴贾雄飞
- 关键词：人结肠癌细胞转运渗透性
