国家自然科学基金(39930050)
- 作品数：10 被引量：16H指数：3
- 相关作者：沈珝琲吴宁华莫志成张业陆瑜更多>>
- 相关机构：中国医学科学院中国协和医科大学中国医学科学院基础医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 热激活Rac-MEKK-JNK信号通路与hsp90β基因表达被引量：3
- 2002年
- 目的探讨Rac-MEKK-JNK(Rac-丝裂原活化的蛋白激酶的激酶的激酶-C-junN端蛋白激酶)信号通路对热诱导hsp90β基因表达的调控作用以及Hsp90蛋白对Rac信号通路传递的调节过程。方法将载体PcDNA3、显性负突变Rac(DN-Rac),显性负突变MEKK(DN-MEKK)和显性负突变JNK(DN-JNK)表达质粒分别与hsp90β基因转录调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因质粒β3.1共转染Jurkat和LETPa-2细胞,采用以竞争性RT-PCR为基础的系统检测CAT报告基因转录水平。用Western印迹分析检测转染了DN-Rac、DN-MEKK和DN-JNK的细胞在热刺激前后c-Jun的表达水平和磷酸化状态。用体外激酶活性分析法检测geldanamycin(GA)对热诱导的JNK活性的影响。结果转染DN-Rac、DN-MEKK及DN-JNK均能抑制42℃1h诱导的β3.1报告基因的表达,Jurkat细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(72.8±5)%、(60±13.2)%及(47.7±12.1)%;LETPa-2细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(16.17±5.1)%、(50.2±8.7)%及(47.5±10)%。转录因子c-Jun的表达和磷酸化水平也在一定程度上被抑制。GA处理细胞可明显抑制热诱导激活的JNK激酶活性和c-Jun的磷酸化水平,但不影响JNK和c-Jun的蛋白表达水平。结论Rac-MEKK-JNK通路参与hsp90β基因的热诱导表达,hsp90可能对热激活化?
- 李晓燕路程吴宁华沈珝琲
- 关键词：HSP90Β基因基因表达调控
- 人Jurkat细胞GAGA样元件结合蛋白cDNA的克隆被引量：3
- 2002年
- 目的探讨人Jurkat细胞中是否存在与GAGA样元件相互作用的结合蛋白。方法采用酵母单杂交体系,在HTLV-1转化的Jurkat细胞cDNA文库中筛选与GAGA样元件相互作用的蛋白;提取人Jurkat细胞总RNA,应用反转录反应标记cDNA探针,与候选的阳性克隆杂交。结果共获得9个阳性克隆,其中6个阳性克隆的插入片段可以与cDNA探针杂交。结论在人Jurkat细胞中有与GAGA样元件相关的结合蛋白。
- 莫志成陆瑜高超吴宁华沈珝琲
- 关键词：JURKAT细胞基因调控
- 检测4种热休克基因表达水平的RT-PCR体系的建立及其应用被引量：1
- 2002年
- 目的建立能同时检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA表达水平的RT-PCR体系。方法采用基因克隆、基因重组、体外转录、RT-PCR技术,建立能同时检测细胞中4种热休克基因的RT-PCR体系,并将此体系用于检测SW13细胞中热休克基因的表达。结果构建了用于4种热休克基因mRNA检测的内参照质粒,并经体外转录成内参照RNA(i-RNA);用于SW13细胞中结果显示:hsp70、hsp90α呈典型的热诱导表达,hsp60和hsp90β具有较高水平的组成性表达,并且呈不同程度的热诱导表达。结论新构建的RT-PCR体系可以用于检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA的表达水平。
- 李宏帆刘兴荣衡凤燕吴宁华沈珝琲
- 关键词：基因表达热休克基因逆转录一聚合酶链反应JURKAT细胞
- 染色质免疫沉淀技术及其在基因表达调控研究中的初步应用被引量：1
- 2004年
- 目的验证抑癌基因表达产物p53蛋白在体内是否结合于p21WAF1/CIP1基因的启动子区,并检测p53蛋白对热休克蛋白hsp90β基因启动子区的结合情况。方法采用染色质免疫沉淀(ChIP)及PCR技术检测特异基因调节序列,Western印迹分析p53蛋白。结果在p53抗体免疫沉淀的DNA片段中含有p21WAF1/CIP1和hsp90β基因的启动子区p53蛋白结合序列,免疫沉淀样品中含有p53蛋白。结论p53蛋白在体内结合于p21WAF1/CIP1和hsp90β基因的启动子区,参与两基因的表达调控。
- 张勇程小款吴宁华沈珝琲
- 关键词：染色质免疫沉淀P53P21^WAF1/CIP1
- 肿瘤抑制剂GA对SH-SY5Y细胞凋亡的影响及分子机制研究被引量：2
- 2004年
- 为了探讨HSP90特异的功能抑制剂geldanamycin(GA)能否用于神经母细胞瘤的临床治疗 ,通过检测未分化的和全反式维甲酸 (RA)诱导分化的神经母细胞瘤SH SY5Y细胞在不同浓度GA处理后的细胞存活率 ,发现GA呈剂量依赖性诱导SH SY5Y细胞凋亡 ,但是分化细胞对同样剂量的GA不是很敏感 [细胞存活率依次为 (82 0±6 0 ) %比较 (6 5 0± 3 0 ) % ,P <0 0 2 ;(6 7 9± 3 1) %比较 (4 3 4± 3 9) % ,P <0 0 3;(4 3± 0 8) %比较 (0 4±0 1) % ,P <0 0 5 ]。Western印迹分析和免疫荧光实验显示 ,GA能抑制细胞中c Jun和c Fos的表达 ,并且GA剂量越高 ,其抑制越明显 ;同时GA也诱导了p5 3的核聚集。与未分化细胞相比 ,在相同剂量GA处理后分化细胞中c Jun和c Fos的表达均比未分化细胞略高 ;但是分化细胞中p5 3的核聚集却不如前者明显。提示未分化细胞对同样剂量的GA比分化细胞更敏感 ,可能与分化细胞能抵抗GA引起的c Jun、c Fos的降低以及p5 3的核聚集有关。
- 沈金花张业吴宁华沈珝琲
- 关键词：C-JUNSH-SY5Y细胞肿瘤抑制分化细胞HSP90
- STAT1对hsp90α基因表达的负调控作用被引量：1
- 2001年
- 目的 探讨转录因子STAT1对hsp90α 基因表达的调控作用。方法 将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞，利用竞争性RT-PCR定量检测其内源性hsp90α 基因mRNA水平。共转染STAT1表达质粒和hsp90α基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因质粒，利用定量RT-PCR检测CAT报告基因转录水平。用Western印迹分析方法检测42℃ 1 h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态，用电泳迁移率变更分析（EMSA）检测STAT1与hsp90α 5′基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度。结果 STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90α基因的表达，又能抑制hsp90α基因5′上游调控区驱动的CAT报告基因活性。热激以前Jurkat细胞中的STAT1 701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化，热激以后其磷酸化程度明显升高，而且STAT1与hsp90α基因 5′上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合。结论 STAT1对hsp90α基因的表达具有负调控作用。
- 陈雪松吴宁华沈珝琲
- 关键词：基因表达调控
- 热休克诱导基因表达谱的变化
- 2001年
- 目的 研究细胞在热应激时的基因表达谱变化。方法 提取热休克前后Jurkat细胞的总RNA，经逆转录合成cDNA探针后分别与人cDNA表达点阵杂交，再用ESTblot软件进行分析，并用Northern印迹证明基因表达的改变。结果 经42℃ 1h热休克的细胞中有40个基因的mRNA表达升高，16个基因的mRNA表达降低。其中除热休克基因表达显著增加外，原癌基因c-Jun、cdc 样激酶CLK-1基因表达明显增加。整合素integrin α-4基因，转化生长因子TGF-β基因表达显著降低。Northern 印迹证明c-Jun及hsp90α基因表达升高。结论 在热应激条件下Jurkat细胞热休克基因、c-Jun、CLK-1基因表达增加，integrin α-4基因、TGF-β基因表达减少。
- 王太宇吴宁华沈珝琲
- 关键词：热休克基因表达
- BTB/POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp900α基因表达的增强作用被引量：1
- 2004年
- 目的 探讨人BTB/POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90α基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90α基因启动子(-1756-+37)的pREP4 episomalvector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90α-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90α-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp900α CAT的表达。
- 陈永军莫志成张旌张业吴宁华沈珝琲
- 关键词：VECTOR
- 环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)参与人hsp90β基因的热诱导表达被引量：2
- 2001年
- 为研究ｃＡＭＰ应答元件（ＣＲＥ）在人热休克蛋白ｈｓｐ９０β基因表达中的作用，构建了数个受ｈｓｐ９０β基因不同长度调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因质粒．分别转染Ｊｕｒｋａｔ细胞并检测４２℃１ｈ热诱导前后 ＣＡＴ活性．结果发现删除ｈｓｐ９０β基因上游含ＣＲＥ片段（－１７３／－９１ｂｐ）后，ＣＡＴ的热诱导表达活性降低了６７％．电泳迁移率变更分析（ＥＭＳＡ）显示热休克后Ｊｕｒｋａｔ细胞的核抽提物中磷酸化的ＣＲＥＢ与该片段呈特异性结合．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验及ＰＫＡ活性检测发现ＣＲＥＢ的磷酸化程度及ＰＫＡ活性均随热诱导时间的延长而增加．以上结果表明：磷酸化的ＣＲＥＢ通过与ｈｓｐ９０β因上游的ＣＲＥ结合参与该基因的热诱导表达，并可能与ＰＫＡ传导途径有关．
- 刘秉胜吴宁华沈珝琲
- 关键词：HSP90Β基因CREB结合蛋白
