国家自然科学基金(30672333)
- 作品数：2 被引量：5H指数：1
- 相关作者：潘朝斌黄洪章武东辉陈伟良李劲松更多>>
- 相关机构：中山大学附属第二医院中山大学中山大学附属第一医院更多>>
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- 微小RNA-21反义寡核苷酸对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用被引量：5
- 2009年
- 目的探讨微小RNA-21(miR-21)反义寡核苷酸(miR-21ASO)对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控作用。方法通过转染miR-21ASO,采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测舌鳞癌细胞株SCC-15和CAL27中miR-21的表达变化,荧光素酶活性检测实验分析miR-21ASO在舌鳞癌细胞中的调控功能,并运用多种细胞增殖和凋亡检测方法以观察miR-21ASO对舌鳞癌细胞调控产生的系列效应。结果miR-21在两株舌鳞癌细胞SCC-15和CAL27中的表达显著高于在正常舌鳞状上皮细胞中的表达(P=0.037,0.015),转染miR-21ASO可显著抑制其表达(P=0.017,0.006),miR-21对荧光素酶活性的抑制率由50%显著减少到20%以下(P=0.002,0.003),SCC-15和CAL27细胞存活率比转染前明显降低(P=0.002,0.004),细胞克隆形成率比转染前明显降低(P=0.007,0.032);流式细胞仪检测显示转染miR-21ASO后,SCC-15和CAL27细胞凋亡明显增加,激光共聚焦显微镜观察到线粒体细胞色素C释放较转染前增加。结论miR-21ASO对舌鳞癌细胞miR-21水平降低具有靶向特异性,转染miR-21ASO可有效抑制miR-21的促癌效应,利用反义核酸技术的高度特异性开展针对促癌microRNA分子的靶向治疗将可能为舌鳞癌的基因治疗开辟新的途径。
- 李劲松黄洪章潘朝斌陈伟良武东辉林钊宇张佩琢
- 关键词：舌鳞癌MIR-21反义寡核苷酸凋亡
- 靶向人端粒酶反转录酶RNA干扰载体质粒的构建与筛选
- 2008年
- 目的:设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列,构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒,采用共转染工具细胞筛选出有效靶点。方法:首先以EASYTMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列,合成shRNA oligo表达框架,将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP,重组质粒转化DH5α,阳性克隆进行PCR与测序鉴定;然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段,与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化,阳性克隆行PCR与测序鉴定,荧光镜检GFP表达;最后上述2个质粒系统共转染293T细胞,Western印迹检测hTERT蛋白表达水平,筛选最有效序列。应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析。结果:BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中,且不与其他基因同源;PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组。hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp,经酶切与质粒连接,形成pEGFP-C1-hTERT表达载体,阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组;转染293T细胞48h时荧光镜下可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白。hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞,48h时Western印迹检测结果显示:实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少,而内参对照β-actin和GAPDH无明显变化。经β-actin校正,得到各组hTERT蛋白相对表达量:KD No.1-5实验组与NC组相比,hTERT基因表达均得到不同程度的敲减(54.61%～76.84%,P<0.05),其中No.4敲减效能最高。结论:5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平,其中以5’-GCAAGTTGCAAAGCATTGGAA-3’敲减效能最优;构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞,可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶。
- 陈丹黄洪章潘朝斌王建广张彬钱永
- 关键词：RNA干扰人端粒酶反转录酶质粒构建基因转染
