浙江省自然科学基金(ZA0105)
- 作品数：9 被引量：89H指数：6
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- 萧山鸡IL-2基因真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达被引量：2
- 2003年
- 扩增萧山鸡白细胞介素2(IL-2)基因,将其插入真核表达载体pCI构建重组质粒pCI-IL-2,高压电击法将重组质粒转化入减毒沙门氏菌,并直接转染Vero细胞,提取细胞总DNA,DIG标记探针可检测到阳性杂交信号。用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验,可检测到特异性黄绿色荧光。SDS-PAGE和Westernblotting可检测到18.5kD和14.5kD的蛋白条带。表明减毒沙门氏菌能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达IL-2,且表达产物具有免疫反应性,为今后研制鸡IL-2基因作为口服免疫增强剂提供了依据。
- 谢荣辉方维焕李建荣卢觅佳于涟
- 关键词：萧山鸡IL-2基因真核表达载体VERO细胞减毒沙门氏菌白细胞介素2
- 鸡白细胞介素2在毕赤酵母细胞中的表达被引量：14
- 2004年
- 目的 利用Pichia酵母真核细胞表达系统表达重组鸡白细胞介素 2 (IL 2 ) ,为大量制备鸡IL 2奠定基础。方法 将ConA激活的鸡脾脏T淋巴细胞中扩增得到的我国地方品种萧山鸡IL 2基因 ,克隆入pPIC9载体中构建重组质粒。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞 ,甲醇诱导蛋白质表达。结果 SDS PAGE和Westernblot均在 30ku处检测到特异条带。结论 表明重组鸡IL
- 许健樊拥军李龙万旺军李建荣于涟
- 关键词：鸡IL-2毕赤酵母免疫增强剂
- 新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达被引量：10
- 2007年
- 以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板,设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增,获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段,BamHⅠ/HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c,获得重组质粒分别命名为pET32c-HNa、pET32c-HNb和pET32c-HNa-L-b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。
- 陈亚波徐程张桂芝方维焕
- 关键词：新城疫病毒结构域抗原表位原核表达
- 重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响被引量：10
- 2005年
- 将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。
- 陈雪燕JOHN M.Dikki江玲丽帅江冰方维焕
- 关键词：减毒沙门氏菌侵袭力稳定性
- 减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗诱导对新城疫病毒的免疫保护被引量：11
- 2003年
- 探讨了以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递新城疫病毒 DNA疫苗的安全性、免疫原性和可行性。将含新城疫病毒 ( NDV) F4 8E9株融合蛋白 ( F)基因的真核表达质粒 pc DNA3- F的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 ZJ111株 ( ZJ111/ pc D-NA3- F菌株 ) ,以 10 8CFU进行首免 ,2周后二免 ,二免后 4周攻击强毒株 F4 8E9,观察其安全性和免疫原性 ,同时设只含空载体 pc DNA3的 ZJ111/ pc DNA3菌株对照及口服 PBS对照。结果表明 :重组 ZJ111/ pc DNA3- F菌株具有良好的安全性 ,对强毒株攻击的保护率达 6 4 .7%。重组 ZJ111/ pc DNA3- F菌株不仅能诱导雏鸡产生 NDV EL ISA抗体 ,而且诱导产生的法氏囊 B淋巴细胞和胸腺 T淋巴细胞增殖反应显著高于 ZJ111/ pc DNA3对照组。这些结果提示 ,减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将 NDV F基因呈递给鸡体细胞进行表达 ,产生抗 NDV的体液免疫 ,而且还可诱导细胞免疫应答。
- 方维焕梁雪芽李建荣
- 关键词：减毒沙门氏菌DNA疫苗新城疫病毒免疫保护免疫原性
- 鸡新城疫口服DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫效力被引量：29
- 2003年
- 将含新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株融合蛋白 (F)基因的真核表达质粒pcDNA3 F的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株 (ZJ111 pcDAN3 F)口服接种小鼠和雏鸡。结果表明 :利用该减毒株作为载体传递DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和PCR鉴定法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。ZJ111 pc DAN3 F以每羽 10 8cfu免疫雏鸡 ,2周后二免 ,二免后 4周攻击致死剂量的强毒株F4 8E9,观察其免疫效力。结果表明 :重组ZJ111 pcDNA3 F菌株不仅能诱导雏鸡产生抗NDV抗体 ,而且能诱导法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞的增殖反应 ,对强毒株攻击的保护率为 6 6 7% ,高于pcDNA3 F裸质粒DNA疫苗注射免疫组 (5 0 % )。上述结果初步提示减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性 ,为研制低成本、实用化的口服禽类DNA疫苗奠定了基础。
- 梁雪芽方维焕江玲丽
- 关键词：新城疫安全性稳定性免疫效力减毒沙门氏菌
- 鸡白细胞介素18全长基因的克隆、表达及分子进化分析被引量：3
- 2007年
- 根据鸡白细胞介素18(IL-18)cDNA基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术,从脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的我国地方品种萧山鸡原代鸡脾细胞中扩增并克隆鸡IL-18全长基因(Genbank accession,AY628648)。扩增片段全长591 bp,共编码197个氨基酸的前体蛋白,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡IL-18全长基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性为98.99%,只在引导序列中出现两个氨基酸残基的缺失,分子进化分析表明萧山鸡IL-18基因与火鸡以及家鸭基因形成一个独立的分支。将萧山鸡IL-18成熟蛋白序列插入pGEX-4T-2载体并在E.coli中得到表达,获得45 kD的GST-IL-18融合蛋白,经纯化后用于制备多克隆抗体。本研究对萧山鸡白细胞介素18的全长基因进行了克隆及表达,并对其分子进化进行了分析,为深入研究其功能奠定了基础。
- 许健于涟李龙由振强万旺军刘岩
- 关键词：鸡白细胞介素18克隆分子进化
- 减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因被引量：6
- 2004年
- 用长距离RT PCR扩增了传染性法氏囊病病毒 (infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)ZJ2 0 0 0株多聚蛋白基因 ,定向克隆入真核表达载体pCI,电转化dam- 和phoP- 双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株 ,并直接转染Vero细胞。RT PCR和间接免疫荧光试验可从Vero细胞中检测到阳性信号 ,SDS PAGE和West blotting均可检测到 4 1kD的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌可将外源基因导入Vero细胞 ,并进行转录和表达 ,具有免疫反应性 ,为进一步研制减毒沙门氏菌为载体的IBDV口服DNA疫苗打下基础。
- 李龙方维焕樊拥军许健方立李建荣于涟
- 关键词：鸡传染性法氏囊病病毒减毒沙门氏菌
- 新城疫病毒F蛋白结构域基因原核表达与抗原表位分析被引量：7
- 2006年
- 以含新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因的重组质粒为模板,设计特异引物进行重叠-延伸PCR扩增获得F基因的抗原结构域基因片段Fa、Fb和Fa-l-Fb,经SalⅠ和NotⅠ酶切后,定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-Fa、pGEX-Fb和pGEX-Fa-l-Fb;用定点突变方法获得重组质粒pGEX-Fa-mut.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌经IPTG诱导、提取表达产物进行蛋白电泳和免疫印迹分析.结果表明:Fa-mut、Fb和Fa-l-Fb结构域基因均获得了融合表达,表达产物与NDV阳性血清具有免疫反应性;与pGEX-Fa-mut不同,pGEX-Fa重组质粒在大肠杆菌中未能表达,且转化菌在IPTG诱导过程中未见生长,提示未经突变的Fa片段可能为毒性蛋白.三维结构预测结果显示,目的蛋白片段中均保留F蛋白中原有相应的抗原表位.
- 张桂芝陈亚波徐程张朝政方维焕
- 关键词：新城疫病毒融合蛋白结构域抗原表位原核表达
