广东省自然科学基金(04003534)
- 作品数：10 被引量：30H指数：4
- 相关作者：王捷杨静杜红延刘大志郑霖更多>>
- 相关机构：广州军区广州总医院华南理工大学更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金广东省医学科学技术研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定被引量：6
- 2006年
- 目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7。腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上。结论获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件。
- 王捷刘增田杨太成杨静冼江刘大志
- 关键词：单克隆抗体
- 人骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达(英文)
- 2005年
- 背景:人骨唾液蛋白基因在矿化组织以外的易发生骨转移的人乳腺癌中表达。临床观察显示骨转移处的乳腺癌细胞骨唾液蛋白的表达量要高于原发部位的乳腺癌细胞,因此骨唾液蛋白有可能与肿瘤特异性骨转移的关系密切。研究乳腺癌骨转移可为将来临床的预防和治疗提供新的药物靶点。目的:建立骨唾液蛋白的稳定表达乳腺癌细胞系,观察骨唾液蛋白在乳腺癌骨转移的整个过程中的作用。设计:对照实验。单位:华南理工大学生物科学与工程学院,解放军广州军区广州总医院医学实验中心。材料:实验于2003-11/2004-03在解放军广州军区广州总医院医学实验室完成。质粒、菌种和细胞:pIRES2-EGFP载体质粒,E.Coli.Top10、含有人骨唾液蛋白基因全长的克隆载体pB-hBSP和发生特异性骨转移以及脑转移的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO和MDA-MB-231BR。方法:将人骨唾液蛋白基因通过聚合酶链式反应的方法从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆出来,在其5’和3’端分别引入BglⅡ和PstⅠ限制性酶切位点,定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性脑转移和骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BR和MDA-MB-231BO中。主要观察指标:pIRES2-hBSP-EGFP重组表达载体的构建。重组表达载体pIRES2-hBSP-EGFP转染乳腺癌细胞。结果:①成功构建人骨唾液蛋白和绿色荧光蛋白非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP。②成功转染特异骨转移和脑转移的乳腺癌细胞株,可在荧光显微镜下观察到荧光蛋白标记,人骨唾液蛋白得到相应表达。结论:真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP的构建及转染可为骨唾液蛋白在乳腺癌骨转移中的作用的体内、外研究奠定一定的基础。
- 杜红延王捷郭勇郑霖杨静
- 关键词：乳腺肿瘤转染
- 骨唾液蛋白(BSP)高稳定表达对乳腺癌骨转移的促进作用被引量：14
- 2007年
- 目的了解乳腺癌细胞中骨唾液蛋白(BSP)高稳定表达对其骨转移的影响,为乳腺癌骨转移的预防和治疗寻找新的药物靶点。方法通过鸡胚尿囊绒膜实验和骨条黏附实验确定BSP的高稳定表达对乳腺癌细胞血管侵袭能力及骨条黏附能力的影响。将乳腺癌细胞种植于鸡胚尿囊膜的上部空腔,经过孵育收集下囊腔血管组织,PCR检测人特异的Alu基因,以了解乳腺癌细胞的血管侵袭能力;将乳腺癌细胞与经胶原酶和胰蛋白酶消化的骨条共同孵育,胰酶消化收集乳腺癌细胞,通过染色测定OD_(488)值来确定乳腺癌细胞对骨条的黏附。结果空白对照组和未经转染的乳腺癌细胞组各5个鸡胚中均没有扩增出人的Alu基因,BSP高稳定表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(piE))各5个鸡胚中分别有4个和3个扩增出人Alu基因;乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)的骨条黏附实验测得的488nm处的吸光度值分别为0.580±0.046和0.490±0.039,明显高于未经转染的乳腺癌细胞组(0.260±0.021,P<0.05)和空白对照组(0.034±0.003,P<0.01)。结论BSP的高稳定表达增加了乳腺癌细胞的血管侵袭能力,提高了乳腺癌细胞的骨条黏附能力,可能对乳腺癌的骨转移有一定促进作用。
- 杜红延王捷杨静郑霖刘大志
- 关键词：唾液糖蛋白类肿瘤转移
- hBSP稳定转染乳腺癌细胞的筛选和鉴定
- 2007年
- 目的筛选和鉴定人骨唾液蛋白(BSP)的荧光蛋白非融合表达载体和膜靶向表达载体稳定转染的乳腺癌细胞,为BSP在乳腺癌骨转移中作用的进一步体内、外研究奠定基础。方法经过4周400μg/mlG418的抗性筛选结合流式细胞仪荧光分选系统获得稳定转染乳腺癌细胞。采用RT-PCR、ELISA以及Western-blotting等方法检测和鉴定BSP在乳腺癌细胞中基因水平和蛋白水平的表达情况。结果筛选获得的乳腺癌细胞中BSP得到稳定表达,以β-肌动蛋白为内参,与空白对照相比BSP蛋白在基因水平上灰度比值从0.446分别增加为0.993和0.942;同时ELISA和Western-bolt实验结果证明BSP蛋白分泌表达和细胞内表达的量也均有所提高。结论稳定高表达BSP的乳腺癌细胞的获得为进一步BSP在乳腺癌骨转移中的作用的体内外试验研究奠定基础。
- 杜红延王捷郑霖杨静刘大志
- 关键词：骨唾液蛋白稳定转染乳腺癌细胞
- 乳腺癌骨转移的特异性分子机制研究被引量：4
- 2004年
- 杜红延王捷郭勇
- 关键词：乳腺癌骨转移分子机制女性恶性肿瘤远处转移器官
- 重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究被引量：3
- 2006年
- 目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。
- 董燕王捷谭刘欣张宏斌武婕
- 关键词：毕赤酵母纯化活性
- 人骨唾液蛋白膜靶向表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达被引量：2
- 2006年
- 目的构建人骨唾液蛋白(BSP)膜靶向表达载体,并转染人乳腺癌细胞,筛选获得稳定转染细胞,为进一步体内外研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定基础。方法通过PCR的方法从pB-hBSP载体中亚克隆人骨唾液蛋白hbsp基因,定向克隆至细胞膜靶向定位真核表达载体pDisplayTM中,构建中间重组载体pDisplay-hB-SP,再次通过PCR的方法从构建的pDisplay-hBSP载体中亚克隆出膜靶向信号肽、hbsp以及细胞膜定位蛋白基因,定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组复合载体pID-hBSP-EGFP,利用脂质体转染特异性骨转移的乳腺癌细胞。结果重组载体pDisplay-hBSP和pID-hBSP-EGFP插入目的片段的测序结果与Genbank中发表的BSP序列基本一致。结论成功构建了人骨唾液蛋白膜靶向表达载体,并且经转染后成功在特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO中表达。为下一步进行体内外试验研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定基础。
- 杜红延王捷郑霖杨静刘大志
- 关键词：骨唾液蛋白细胞膜绿色荧光蛋白乳腺癌细胞
- BSP的高稳定表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响被引量：4
- 2006年
- 目的研究骨唾液蛋白(BSP)的高稳定表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响,揭示BSP在乳腺癌骨转移中的作用。方法通过细胞生长曲线实验、肿瘤细胞克隆形成率实验以及细胞黏附性实验,研究高稳定表达hBSP对乳腺癌细胞生物学行为的影响。结果hBSP的高稳定表达增加了乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)的生长速率,提高了其活性和致瘤性。乳腺癌细胞MDA-MB-231BO的克隆形成率为8.90%±0.53%,明显低于MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)(分别为15.6%±0.94%和12.8%±0.77%),同时乳腺癌细胞MDA-MB-231BO的细胞贴壁率OD620的值(0.29±0.017)也明显低于MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)(分别为0.52±0.03和0.43±0.03)。结论hBSP具有一定的自分泌作用,增加BSP的表达促进乳腺癌细胞骨转移的发生。
- 杜红延王捷郑霖杨静刘大志
- 关键词：唾液糖蛋白类肿瘤转移
- hBSP与GFP非融合表达载体的构建及乳腺癌细胞转染条件优化被引量：2
- 2005年
- 为进一步研究骨唾液蛋白(BSP)在乳腺癌细胞骨转移的整个过程中的作用,首先要建立稳定高效表达BSP的乳腺癌细胞系.文中首先从构建好的pB-hBSP载体中亚克隆hbsp基因,构建重组质粒pIRES2-hBSP-EGFP,然后利用脂质体介导转染特异性骨转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231BO,优化一系列转染条件以提高转染效率,再利用G418和流式细胞仪筛选获得稳定转染细胞.结果发现:在96孔板中,细胞融合度达到90%;用1μg脂质体介导280 ng重组质粒转染10 h,转染效率最高可达(19.70±1.10)%.
- 杜红延王捷郭勇郑霖杨静刘大志
- 关键词：骨唾液蛋白荧光蛋白重组表达载体乳腺癌细胞
- 骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达被引量：3
- 2005年
- 目的构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法从构建好的pB hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2EGFP,构建重组载体pIRES2hBSP EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA MB231BO中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果成功构建hB SP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论真核表达载体pIRES2hBSP EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。
- 杜红延王捷郭勇郑霖杨静刘大志
- 关键词：骨唾液蛋白荧光蛋白乳腺癌细胞基因转染
