国家自然科学基金(81101421)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：李永明张玉强吕刚范仲凯贾志强更多>>
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- NGFβ/HIF-1α双重转染的骨髓间充质干细胞对神经元轴突再生的作用被引量：3
- 2014年
- 目的观察神经生长因子β(nerve growth factorβ,NGFβ)/低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)双重转染的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对神经元轴突再生微环境的改善作用,为完善微环境中轴突再生的理论提供资料。方法分别构建携带编码NGFβ、HIF-1α的慢病毒载体,用最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染BMSCs后,Western blot检测转染后的BMSCs表达NGFβ、HIF-1α的情况。培养SD大鼠皮质神经元并将其与转染后的BMSCs用Transwell双层培养板构建共培养体系。将共培养体系在厌氧培养罐中培养48 h后,用ELISA方法检测神经元培养上清液中NGFβ、HIF-1α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达水平,并用Image pro-Plus软件测量神经元轴突的长度。实验分组:A组:单独培养神经元;B组:BMSCs与神经元共培养;C组:NGFβ转染的BMSCs与神经元共培养;D组:HIF-1α转染的BMSCs与神经元共培养;E组:NGFβ/HIF-1α双重转染的BMSCs与神经元共培养。结果 Le-RFP-NGFβ和Le-GFP-HIF-1α基因转染BMSCs转染率分别为84.83%和89.63%。Western blot检测显示,转染后的BMSCs能表达目的蛋白NGFβ和HIF-1α。共培养体系ELISA检测结果显示,C组和E组的NGFβ的表达量明显高于A、B组(P<0.05);D组和E组的HIF-1α的表达量明显高于A、B组(P<0.05)。D、E两组的VEGF表达量高于A、B两组(P<0.05)。Image pro-Plus测量神经元轴突长度结果显示,C、D、E组大于A、B两组(P<0.05),E组大于C、D组(P<0.05)。结论与NGFβ/HIF-1α双重转染BMSCs共培养的神经元轴突生长情况良好,在共培养环境中对神经元存活发挥重要作用的NGFβ、HIF-1α、VEGF等因子高表达。
- 庄培袁吕刚范仲凯李永明张玉强贾志强
- 关键词：骨髓间充质干细胞低氧诱导因子-1Α轴突再生
- HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定
- 2014年
- 目的构建pAdeno-EGFP-HIF-1α重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法扩增目的基因HIF-1α并亚克隆到含有报告基因EGFP的pShuttle-CMV-EGFP穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1α重组穿梭质粒。将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno骨架载体上,获得pAdenoEGFP-HIF-1α重组腺病毒质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后进行PCR鉴定并测定病毒滴度。结果 pShuttle-EGFPHIF-1α经KpnI/BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb和5.1 kb处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1kb处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1α重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1α重组穿梭质粒与pAdeno载体重组后,经XhoI单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1α重组腺病毒成功包装纯化后经PCR鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1α基因;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010 PUF/ml。结论成功构建了HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础。
- 李永明吕刚范仲凯曹阳王岩松庄培袁张玉强李刚
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体
