国家自然科学基金(31201775)
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- 山羊SPRN基因真核表达载体的构建
- 2013年
- 以山羊小脑cDNA为模板,利用RT-PCR法扩增获得了SPRN基因完整编码区片段,将其连接到pMD19-T载体上,转化感受态JM109后,筛选并鉴定阳性克隆,通过序列测量,将序列正确的片段双酶切后连接到真核表达载体pEGFP-N1上。结果表明,成功构建了山羊SPRN基因完整编码区的真核表达载体。
- 周荣艳陈辉张振红锡建中李兰会李祥龙李秀岭
- 关键词：山羊RT-PCR真核表达载体
- 太行山羊SPRN基因的克隆与半定量RT-PCR分析
- 2013年
- 为研究太行山羊SPRN基因的结构及其在不同组织中的表达水平,参考绵羊和牛SPRN基因序列设计引物,应用PCR技术获得了太行山羊SPRN基因的核苷酸序列,同时对该基因进行生物信息学分析,并通过半定量RT-PCR进行组织表达谱分析。结果显示,克隆的太行山羊SPRN基因序列长度为4 237bp,含有441bp的完整开放阅读框,编码146个氨基酸,与绵羊和牛的对应基因序列同源性分别达到95%和93%。SPRN基因在山羊小脑和大脑中表达水平较高,在睾丸、肠系膜淋巴结和肺脏中表达量很低。
- 张军杰周荣艳李祥龙陈辉张振红锡建中李兰会李秀岭
- 关键词：山羊克隆组织表达谱
- 山羊PRNP基因启动子转录活性研究
- 2016年
- 【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路;【方法】以山羊PRNP基因序列(Gen Bank登录号:EU870890)为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至p EASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至p EASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测;【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519—+82 bp,且在-220—+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启�
- 周荣艳魏彦辉锡建中李兰会陈辉高立杰张振红
- 关键词：山羊启动子转录活性
