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阿德福韦酯治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析被引量：9: 2013年; 目的鉴定1例阿德福韦酯(ADV)治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtN236V,并分析其表型耐药特点。方法从1例ADV治疗失败患者的血清中提取HBV DNA,采用巢式PCR扩增HBV RT区,将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体,转化JM109细胞。挑选34个阳性克隆进行DNA测序并分析耐药相关突变。构建1.1倍HBV野生株和耐药株重组载体,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后分别加入不同浓度的拉米夫定(LAM)、ADV、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF),转染后第4天收集细胞培养液,采用实时荧光定量PCR法检测不同药物浓度作用下细胞培养上清中HBV DNA的产量,并分析其表型耐药特点。结果该例患者在接受ADV治疗15个月后出现病毒学突破和生化学突破,测序结果显示34个克隆中,20个(58.8%)为rtN236V变异株,11个(32.4%)为rtN236T变异株,2个(5.9%)为野生株,1个(2.9%)为rtA181V+N236V变异株。rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V变异株的相对病毒复制力分别为野生株的89.43%、83.60%和75.44%。表型耐药分析显示:rtN236T株、rtN236V株和rtA181V+N236V株对ADV的敏感性分别为野生株的1/4.75、1/3.10和1/5.10,但对LAM、ETV和TDF均敏感。结论在ADV长期治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清病毒池中鉴定了新的变异形式rtN236V,并与rtN236T和rtA181V株伴随存在,该变异降低了病毒的复制力及对ADV的敏感性,可能是一个新的ADV耐药相关变异。; 王晓刘妍思兰兰陈丽白文林刘立明王嫣许智慧戴久增姚增涛徐东平; 关键词：肝炎病毒乙型病毒

明胶-壳聚糖复合纳米纤维膜对糖尿病大鼠皮肤损伤的修复作用被引量：2: 2014年; 目的观察明胶-壳聚糖复合纳米纤维膜对于糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠皮肤缺损修复的作用。方法采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素建立DM大鼠模型。药膜实验组大鼠皮肤缺损部位用明胶-壳聚糖复合纳米纤维膜覆盖后,油纱及干纱布包扎缝合固定;对照组大鼠皮肤缺损部位仅用油纱及干纱布包扎缝合固定。观察创口面积及创口愈合率。结果术后14 d,经明胶-壳聚糖复合纳米纤维膜处理的实验组DM大鼠创口较模型组小,创口愈合率明显高于对照组。结论明胶-壳聚糖复合纳米纤维膜具有促进DM大鼠缺损皮肤修复的作用。; 楼陆军罗肇璋高云罗瑞英罗洁霞; 关键词：糖尿病皮肤损伤明胶壳聚糖

新型中药制剂肃毒星对乙型肝炎病毒体外复制的抑制作用研究被引量：6: 2014年; 目的观察新型中药制剂肃毒星对野生和恩替卡韦(ETV)耐药乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用。方法以不同浓度(0、0.0005﹑0.001﹑0.005﹑0.01mg/ml)的肃毒星分别处理HepG2.2.15细胞(D基因型/ayw亚型野生HBV稳定复制细胞系)和HepG2.A64细胞(C基因型/adr亚型ETV耐药HBV稳定复制细胞系),作用时间4d。采用酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg含量的变化;提取细胞内病毒核心颗粒,采用实时荧光定量PCR方法检测两种细胞内HBV DNA复制水平的变化。观察不同作用时间下,药物对HBV DNA的抑制作用。结果肃毒星对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞内HBV DNA复制和HBsAg、HBeAg的分泌均有明显抑制作用,且具有药物剂量和时间依赖性,最高浓度(0.01mg/ml)的肃毒星对HepG2.2.15细胞内病毒的抑制率达到80.83%,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别达51.00%和64.05%;而对HepG2.A64细胞内HBV DNA抑制率为65.18%,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为32.85%和73.86%。随肃毒星作用时间延长,其对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制效果增强,但未显示对HepG2.A64细胞内ETV耐药型HBV株病毒抑制率增强的效果。结论体外细胞培养实验中,肃毒星不仅可有效抑制野生HBV复制和抗原分泌,而且对ETV耐药HBV的复制和抗原分泌也具有很好的抑制作用。; 姚伟明刘妍思兰兰许智慧李鹏高卜绿萍兰金初徐东平

急性乙型肝炎病毒感染的免疫应答被引量：4: 2013年; 乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus，HBV）感染机体后主要有两种结局：急性自限性和慢性持续性。机体能否清除病毒，取决于感染者的年龄和免疫状态。免疫功能健全的成年人感染后大多呈现为自限性。儿童、免疫力缺陷的成年人或者母婴传播多表现为持续性感染。机体产生有效的免疫应答是清除HBV的关键因素，并且与肝脏的炎症和疾病的进展有关［1］。目前人们对HBV感染的发病机制和免疫应答还不完全清楚。本文就急性HBV感染过程中机体的免疫应答的相关进展以及争议作一综述。; 王俊忠朱华斌杨东亮; 关键词：乙型肝炎病毒感染免疫应答慢性持续性免疫状态

结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识被引量：16: 2012年; 核苷(酸)类似物是临床上治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染最常用的药物,但长期应用可引发病毒耐药,导致治疗失败。基因变异检测及表型耐药分析是发现和鉴定HBV耐药的基本方法,前者主要是应用基因测序或线性反向探针杂交等方法,检出已知的病毒耐药相关突变,后者则是在体外细胞水平确定携带有变异基因的HBV毒株对病毒复制力及核苷(酸)类药物敏感性的影响,是鉴定复杂与特殊HBV耐药变异的基本手段。我们通过技术创新,建立了敏感、特异、经济、高效的HBV基因型检测方法,进而建立了可靠的HBV复制力和表型耐药分析方法,广泛应用于临床样本分析,实现了对HBV耐药的早期发现及对新的非典型HBV耐药相关突变株的鉴定。我们近期在核苷(酸)类似物耐药和应答不佳的患者中检测到多种特殊和复杂HBV耐药相关突变,并结合临床资料,进一步对代表性变异株进行病毒复制力和表型耐药分析,取得了多项重要发现:①从大样本中检出和鉴定了多种多重耐药HBV变异株,并发现联合用药可协同抑制多重耐药HBV变异株的体外复制;②HBV rtL229替换可作为补偿变异,恢复拉米夫定耐药变异株rtM204I的病毒复制力;③rtM204Q是一种新的拉米夫定耐药相关突变;④rtA181C+rtL180M+rtM204V与恩替卡韦耐药相关;⑤同一耐药患者血清HBV虽检出耐药变异,但外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中的HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,提示PBMCs为体内HBV野生株的"存储库",参与HBV肝外感染。上述发现对深入揭示HBV耐药变异的临床特点和发生机制,辅助临床合理制定并优化抗病毒治疗方案具有重要作用。; 徐东平刘妍; 关键词：突变表型

我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点被引量：19: 2012年; 目的分析我国大样本来源的慢性乙肝病毒(HBV)感染患者多重耐药HBV的基因型和表型特点。方法回顾性分析11 800例慢性乙肝患者血清中HBV反转录酶(RT)区与核苷(酸)类似物耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对其中的46例多重耐药HBV突变株进行鉴定。采用体外表型耐药分析法检测核苷类与核苷酸类联合处理对多重耐药HBV的抑制效果。分析临床治疗方案在多重耐药HBV感染的发生及控制中的作用。结果在11 800例慢性HBV感染者中,共3658例(31.0%)检出核苷(酸)类耐药相关突变,其中拉米夫定(LAM)耐药突变2592例(70.9%),阿德福韦酯(ADV)耐药突变665例(18.2%),恩替卡韦(ETV)耐药突变293例(8.0%),替比夫定(LdT)耐药突变62例(1.7%),同时针对核苷类和核苷酸类的多重耐药(MDR)突变46例(1.3%)。对46例多重耐药感染样本的克隆测序显示,40例样本在同一病毒基因组上检出MDR突变,其他6例样本的MDR突变则存在于不同的HBV基因组中。基因型分析显示共有15种病毒变异形式,同时耐LAM(或LdT)和ADV,以及同时耐ETV和ADV的MDR株分别为10种和5种。体外表型耐药分析结果显示,ETV(或LAM)和ADV联合用药可有效抑制HepG2细胞内MDR HBV的复制,但对野生株无类似效果。临床用药方案分析显示,多重耐药HBV感染常出现在LAM(或)LdT、ADV、ETV序贯治疗的患者,以LAM→ADV(22例)和LAM→ADV→ETV(10例)最多见,发生多重耐药后大多出现病毒学和(或)生化学突破。LAM+ADV或ETV+ADV联合挽救治疗可成功将大多数多重耐药HBV的DNA复制控制在检测不到的水平。结论我国MDR HBV株具有多样性和复杂性,表型分析和临床观察均证实核苷与核苷酸类似物联合使用可有效控制MDR HBV复制。多重耐药HBV感染的发生与临床长期应用核苷(酸)类似物序贯治疗有关,密切监测病毒应答及耐药突变对于临床尽早制定最优的抗; 刘妍许智慧刘立明李乐茹超陈丽白文林李晓东姚增涛思兰兰纪冬辛绍杰徐东平

乙肝病毒多聚酶区rtL229突变的演变及其表型分析被引量：5: 2012年; 目的分析乙肝病毒(HBV)多聚酶的反转录酶(RT)功能域rtL229突变的演变规律及其与拉米夫定(LAM)耐药的相关性。方法回顾性分析2010年8月在解放军302医院抗病毒治疗过程中发生rtL229F突变的1例慢性乙肝患者的临床资料,从其动态血清中扩增HBV RT基因并克隆测序(>20个克隆/样本)以观测rtL229F突变的演变过程。同时将含有不同突变形式(rtM204I、rtL229F以及rtM204I+rtL229F)的HBV DNA RT区基因定向克隆至HBV1.1载体中获得可复制的HBV复制子,将复制子转染HepG2细胞,在含或不含核苷(酸)类似物[LAM、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦酯(TDF)]的培养基中连续培养4d,采用实时荧光定量PCR法检测上清中产生的HBV DNA。结果 LAM治疗过程中,rtL229F突变可继发于rtM204I突变,而停用LAM后可逐渐回复为野生型。表型分析结果显示,单独rtL229F突变不改变病毒的药物敏感性,而与rtM204I突变联合后可以增强突变HBV的LAM耐药性。结论 rtL229F位点突变是LAM耐药突变的补偿突变,与LAM应答不佳相关,且对ADV、ETV及TDF敏感。; 纪冬刘妍许智慧李乐陈丽李晓东陈国凤辛绍杰徐东平; 关键词：突变抗病毒药

接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtM204Q的表型特点分析被引量：4: 2012年; 目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体。采用FuGENE HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L;替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点。结果对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1%)为野生型,11个(29.7%)为rtM204Q突变型,2个(5.4%)为rtM204I突变型,10个(27.0%)为rtA181T突变型,1个(2.7%)为rtA181T+rtM204Q突变型。后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%(P<0.05)。前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM204I对LAM的敏感性不及野生株的1/1000。rtM204Q和rtM204I株对ADV、ETV和TDF均敏感。结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异。; 王嫣刘妍许智慧思兰兰陈丽戴久增姚增涛徐东平

慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtL180M＋A181C＋M204V的鉴定及表型耐药特点分析被引量：4: 2012年; 目的鉴定经核苷(酸)类似物序贯治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtA181C,并分析其表型耐药特点。方法 2010年6月解放军302医院确诊的慢性乙肝患者1例,提取血清HBV DNA,巢式PCR扩增HBVRT全基因,采用PCR产物直接双向测序结合克隆测序分析HBV RT区12个耐药相关突变位点。构建代表性克隆重组表达载体pTriEx-HBV1.1,瞬时转染人肝癌细胞系HepG2细胞,转染4h后加入不同浓度拉米夫定(LAM,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)、阿德福韦(ADV,终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)、恩替卡韦(ETV,终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替诺福韦(TDF,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L),4d后采用实时荧光定量PCR检测不同药物浓度作用下培养细胞上清中HBV DNA的复制水平并分析其表型耐药特点。结果此例慢性乙肝患者序贯接受LAM治疗36个月→ADV治疗14个月→ETV治疗29个月,而后发生病毒学突破,HBV DNA由阴性升高至1.1×106IU/ml,ALT由正常升高至235U/L。直接测序显示HBV RT基因rtL180M+A181V+M204V变异,克隆测序得到18个克隆,其中9个为rtL180M+A181V+M204V变异株,7个为rtL180M+A181C+M204V变异株,1个为rtV173L+L180M+A181V变异株,1个为野生株。病毒复制力检测结果从高到低依次为:野生株>rtV173L+L180M+A181V>rtL180M+A181C+M204V>rtL180M+A181V+M204V。表型耐药分析显示,与野生株比较,rtL180M+A181V+M204V变异株和rtV173L+L180M+A181V变异株对LAM和ADV不敏感,rtL180M+A181C+M204V变异株对LAM和ETV不敏感。结论长期核苷(酸)类似物序贯治疗可引起多重耐药;rt181位点新的变异rtA181C与ETV长期用药有关,可能是新的ETV耐药变异位点。; 刘佳慧刘妍许智慧王嫣陈丽李乐姚增涛胡景鑫徐东平; 关键词：突变

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艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项(2012ZX10004503)

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