广东省自然科学基金(970092)
- 作品数：9 被引量：33H指数：3
- 相关作者：黄炯烈周国理王玲吴瑜葛春喜更多>>
- 相关机构：中山医科大学广东药学院更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家教育部“211”工程更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- 昆虫CYP6家族多样性与进化被引量：16
- 2002年
- 了解昆虫CYP6家族的多样性与进化 ,对认识昆虫细胞色素P45 0参与抗药性发生、发展的分子生物学机制具有重要的意义。作者就昆虫CYP6家族多样性的各种表现形式及其形成原因、自然进化史。
- 周国理黄炯烈
- 关键词：昆虫多样性进化
- 蚊虫细胞色素P450基因系列研究被引量：1
- 2001年
- 报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近 5年来有关蚊虫细胞色素P45 0基因 (CYP45 0 )系列研究结果 ,包括 :①通过简并引物PCR分别从致倦库蚊、白纹伊蚊及中华按蚊中获得 3个、2个、2个CYP4家族成员基因片段 ;通过简并引物PCR及RT PCR从白纹伊蚊中获得 16个CYP6家族成员基因片段 ;②利用cDNA末端快速扩增 (RACE)法获得了白纹伊蚊CYP6家族 3个新的全长cDNA序列及 7个超过其全长一半以上的cDNA序列。GenBankaccessionnumber分别为AF2 83836 AF2 83838(全长cDNA序列 )和AF2 84782 AF2 84783(非全长cDNA序列 ) ,被国际P45 0命名委员会正式命名为CYP 6N3v1 v3(全长cDNA序列 )和CYP 6N3v4、CYP 6N4v1 v6 ,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中 ;③运用基因步移方法从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP 6N3上游 3 0 76bp调控序列 ;④对白纹伊蚊CYP 6N3、CYP 6N4非翻译区序列功能分析显示 :昆虫CYP45 0与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似 ,但具有多态性的特点 ;⑤对白纹伊蚊CYP 6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示 :蚊虫中CYP45 0转录起始存在着复杂性 ;⑥证实蚊虫中 CYP6存在多样性 ,并分析讨论了此种多样性形成的可能机制 ;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P45 0
- 黄炯烈周国理吴瑜葛春喜王玲
- 关键词：按蚊属伊蚊属库蚊属蚊虫基因扩增
- 基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义被引量：2
- 2001年
- 【目的】快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP 6N3基因 (CYP 6N3)上游启动子区序列。【方法】根据本室已获得的白纹伊蚊CYP 6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的 5′ 末端核苷酸序列 ,设计 2个反向特异引物 (GSP1和GSP2 ) ,利用 4种限制性内切酶 DraⅠ、EcoRⅤ、Pvu Ⅱ和 StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA ,消化产物与适配子连接产生 4种消化的DNA库 (DL1、DL2、DL3及DL4) ,并分别以此为模板 ,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第 1步PCR扩增 ,然后再以第 1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第 2次PCR扩增。【结果】第 1步PCR结果显示 :在上述 4种消化文库中分别扩增出约 80 6、2 190、2 2 0 6和 3 0 76bp的特异条带 ;第 2步PCR结果与第 1次PCR相类似 ,但各泳道主带扩增效率明显升高。【结论】本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其 4种限制性内切酶图谱。此外还对基因步移法在昆虫细胞色素P45 0多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论。
- 周国理黄炯烈吴瑜王玲
- 关键词：伊蚊属细胞色素P450CYP蚊虫
- 白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N亚家族新成员5’-及3’-非翻译区序列功能分析被引量：2
- 2001年
- 目的 获得白纹伊蚊细胞色素P45 0CYP6N亚家族新成员 5’ -及 3’ -非翻译区 (untranslatedregion ,UTR)核苷酸序列 ,并进行功能分析。方法 以本文作者已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株一新的细胞色素P45 0CYP6基因cDNA片段 ,设计 1对特异性引物 ,以反向引物 ,进行 5’ -cDNA末端快速扩增 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE) ,以正向引物进行 3’ -RACE。然后分别进行克隆、测序和鉴定 ,以获得 5’ -UTR和 3’ -UTR ,并运用PC/GENE软件分析其功能。结果 获得CYP6N亚家族中两个新成员 5’ -UTR及 3’ -UTR ;其结构特征包括 :两个新成员前导序列均为 46个核苷酸 ;起始密码子ATG两侧核苷酸 - 3位是A、+ 4位是T ;5’ -UTR区域无稳定性的发卡结构 ;终止密码子在CYP6N3为TAA、在CYP6N4为TAG ,紧挨其 3’端核苷酸分别为A和G ,翻译产物羧基端均为亮氨酸。结论 成功地获得了白纹伊蚊细胞色素P45 0CYP6N亚家族两个新成员 5’ -及 3’ -非翻译区序列 ,进一步分析表明该两个新成员均能进行有效翻译 ,昆虫细胞色素P45 0基因翻译起始调控与翻译终止调控有部分类似于脊椎动物mRNA的翻译调控 ,但具有多态性的特点。
- 周国理黄炯烈吴瑜王玲
- 关键词：白纹伊蚊细胞色素P450非翻译区
- 白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因cDNA片段的克隆与鉴定被引量：10
- 2000年
- 目的】获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因家族中的一个cDNA片段。【方法】根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,进行反转录PCR,获得一大小与设计的细胞色素P450基因片段相符合的cDNA片段。将该片断与pUC19质粒重组,并克隆至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序;将推导的氨基酸序列进行同源性分析,并用PC/GENE软件绘制系统树。【结果】获得了1条长240bp的核酸序列;所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间,但CYP6D1除外,其同源性为29.1%;而与CYP4家族同源性较低,与CYP4C1、CYP4D1、CYP4D2同源性分别为333%、329%和299%;与哺乳动物CYP3A亚家族同源性亦较高;所绘制的系统树显示出与同源性分析相一致的结果。
- 周国理黄炯烈姚其方詹希美葛春喜王玲
- 关键词：伊蚊属杀虫剂抗药性基因扩增
- 白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因的原核表达及鉴定被引量：1
- 2002年
- 目的 对白纹伊蚊细胞色素P4 5 0CYP6N3基因进行原核表达 ,以获得高效表达蛋白。方法 根据CYP6N3基因的全长cRNA为模板进行RT -PCR。产物经T -A克隆测序鉴定后 ,亚克隆入原核融合表达载体 pGEX - 4T - 1(含有编码 2 6KDaGST的基因序列 )中 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行原核表达。将细菌总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,通过Westernblot分析鉴定目的蛋白的位置 ,并运用核酸蛋白分析仪扫描凝胶以确定表达产物的含量。结果 获得了高效表达的融合蛋白GST -CYP6N3,表达量占菌体总蛋白的 37 4 9%。结论 本实验成功地异源表达了白纹伊蚊CYP6N3基因 ,为体外重建细胞色素P4 5 0CYP6N3单加氧酶系 。
- 吴瑜黄炯烈周国理葛春喜王玲
- 关键词：白纹伊蚊细胞色素P450原核表达
- 白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析被引量：2
- 2002年
- 根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的 5′ 末端核苷酸序列 ,设计 2个反向特异引物 (GSP1和GSP2 ) ,利用 4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA ,消化产物与适配子连接产生 4种消化的DNA库 ,并分别以此为模板 ,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第 1步PCR扩增 ,然后再以第 1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第 2次PCR扩增。将扩增产物进行T A克隆及测序。结果显示 :分别以DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ消化的DNA库为模板而获得 4个长短不一的DNA序列 :80 6bp、 2 190bp、 3 0 76bp和 2 2 0 6bp ,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′ 非翻译区序列及氨基端开头 10个氨基酸的编码序列 ;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和 或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件。表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因 4个上游启动子区序列 ,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P45
- 周国理黄炯烈吴瑜王玲
- 关键词：白纹伊蚊细胞色素P450启动子分子克隆
- 白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因分子进化机制初探被引量：3
- 2000年
- 为了初步探讨白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6家族新基因分子进化机理,根据已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株一新的细胞色素P450CYP6基因cDNA片段,设计反向引物,进行5’-cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）;以正向引物进行3’-RACE。然后分别进行克隆、测序和鉴定。根据获得白纹伊蚊CYP6家族新成员全长cDNA序列,运用PC/GENE软件分析其5’-UTP区DNA序列相似性及编码区氨基酸残基相似性、构建系谱树。结果获得的3个全长序列中5’-UTP区DNA序列完全相同;编码区氨基酸残基相似性为3/497或4/497个氨基酸差异,而且此种差异均位于蛋白质功能非保守的基因区域;构建的系谱树显示CYP6N3基因与冈比亚按蚊CYP6N1-2亲缘关系最近,而与致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1亲缘关系较远。说明白纹伊蚊CYP6N3基因较致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1基因更为古老;白纹伊蚊CYP6N3各等位基因变异体是通过整个CYP6N3基因座的新近复制而产生。
- 周国理黄炯烈吴瑜王玲
- 关键词：白纹伊蚊细胞色素P450分子进化变异体
- 白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建被引量：2
- 2001年
- 目的 :构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。方法 :抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫总RNA ,进行反转录合成第 1链cDNA ;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR ,合成全长双链cDNA ;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,然后经 1 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,回收 40 0bp以上的组分 ,并与λTriplEx2载体连接 ;连接产物经体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度 ;随机挑取 9个噬菌体 ,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增 ,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 :经检测 ,未扩增文库滴度达 2 0× 10 7pfu mL ,重组效率在 10 -4 稀释度时每块平板约 2 10～ 2 5 5个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑 ,扩增文库滴度达 1 75× 10 9pfu mL ;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定 ,结果显示 :所选 9个噬菌体中均含有重组的cDNA ,并且均在 5 0 0bp以上 ,其中 1kb以上的有 2个、 70 0bp的有 5个、 5 0 0bp的有 2个。结论 :已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。
- 周国理吴瑜黄炯烈陆家海王玲
- 关键词：白纹伊蚊杀虫剂抗性CDNA文库
