国家教育部博士点基金(20060610091)
- 作品数：10 被引量：19H指数：3
- 相关作者：陈建平田玉王涛刘明杰杨志伟更多>>
- 相关机构：四川大学延安大学成都医学院第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金四川省学术和技术带头人培养资金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 嗜肺军团菌pilE基因的克隆及其原核表达
- 2008年
- 目的克隆嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛蛋白pilE基因,构建重组质粒pET-pilE,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌Ⅳ型菌毛蛋白pilE基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-pilE,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了429bp完整的pilE基因,构建的原核表达重组质粒pET-pilE表达出35.7 kDa的融合蛋白质。结论成功构建了军团菌pilE基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为以后深入研究奠定了基础。
- 杨志伟曹秀琴陈建平
- 关键词：军团菌克隆基因表达
- 嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫应答及其保护力被引量：5
- 2007年
- 目的:研究嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫原性以及对LP感染小鼠的保护能力。方法:用嗜肺军团菌免疫原蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFNγ-产生水平和CTL特异杀伤活性等指标,以评价疫苗的免疫原性。真核表达重组质粒pcDNA3.1-ipDNA疫苗重复免疫BALB/c小鼠2次,末次免疫2周后,用10倍LD50剂量攻击小鼠,计数小鼠的存活数及小鼠肺中的细菌数,观察感染鼠的肺部病理变化。结果:pcDNA3.1-ip免疫小鼠后诱导产生了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答,免疫组的免疫原性和免疫保护性均高于对照组pcDNA3.1(+)组(P<0.01)。结论:免疫原蛋白基因可作为嗜肺军团菌核酸疫苗的侯选基因。
- 杨志伟陈建平王涛田玉
- 关键词：嗜肺军团菌免疫原性DNA疫苗
- 嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达被引量：7
- 2007年
- 目的构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达。结论成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。
- 张雷陈建平张莉王涛刘明杰田玉
- 关键词：嗜肺军团菌克隆
- 延安市286例呼吸科患者血清嗜肺军团菌抗体的检测被引量：1
- 2009年
- 目的了解延安市嗜肺军团菌的感染情况。方法采用微量凝集法对286份呼吸科住院患者血清标本进行嗜肺军团菌Lp1型军团菌抗体测定。结果抗体阳性率为17.13%,其中男为18.56%,女为15.13%;在各年龄组均有嗜肺军团菌Lp1型抗体阳性者,其中40岁年龄组的感染率(26.09%)最高;呼吸科疾病中肺结核患者合并嗜肺军团菌Lp1感染率较高,为26.56%,各疾病类型之间感染率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论延安市存在一定的嗜肺军团菌感染,需加强对军团病血清学的监测工作。
- 景彩霞薛亚娟陈建平
- 关键词：嗜肺军团菌抗体
- 引入CpG基序的嗜肺军团菌lvgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达被引量：2
- 2010年
- 目的构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达。方法采用PCR方法将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞。结果通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpG中lvgA/CpG克隆片段长为657bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合。用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达。结论本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号。
- 景彩霞杨加周刘明杰徐佳楠关望许颖陈建平
- 关键词：嗜肺军团菌CPG基序NIH3T3细胞
- 嗜肺军团菌MompS抗原二级结构分析及表位预测被引量：2
- 2010年
- 目的分析嗜肺军团菌MompS抗原的二级结构并预测其B细胞表位,初步判断其活性多肽所在区域。方法联合运用多种方法对MompS的二级结构和表面特性,如亲水性、理化性质、可及性、免疫原性和可塑性等方面进行分析,预测其抗原表位。结果 MompS存在多个潜在抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位分布于三个区域:M1(353-546)、M2(1-215)、M3(216-399)。体外实验证明,所预测抗原表位区域基本能与免疫血清发生抗原特异性反应。结论应用DNA Star和胞外区在线分析软件能够成功预测MompS抗原的B细胞表位,M3区域可用于后续的活性肽表位筛选区域。
- 许颖陈建平关望牛钦王
- 关键词：B细胞表位
- 一株水源分离军团菌的分子生物学鉴定和系统发育学及毒力分析
- 2012年
- 目的对我室2009年分离获得的一株疑似军团菌菌株(编号为CD-1)进行分子生物学鉴定、系统发育学及毒力分析。方法对CD-1株进行PCR扩增军团菌属特异性16SrRNA作为分子生物学鉴定,扩增其rpoB基因片段并测序进行系统发育学分析。对CD-1株进行PCR扩增以检测其毒力基因mip,并用CD-1株感染BABL/c小鼠以研究其毒力。结果 PCR扩增军团菌属特异性16SrRNA显示CD-1株在650bp处有特异条带,说明CD-1株为一株军团菌,系统发育学分析显示CD-1株与长滩军团菌(Legionella longbeachae)聚为一枝,其后验概率为1.00。对CD-1株进行军团菌毒力基因mip扩增,扩增产物在650bp处有特异条带,显示CD-1株携带有mip基因。动物实验结果显示当感染菌量浓度达到107 cfu/mL时,实验组小鼠全部死亡。结论 CD-1株为一株长滩军团菌,对BALB/c小鼠具有较强毒力,并且有可能对人体致病。这是四川地区分离获得的首株长滩军团菌,也是国内首次对水源分离军团菌毒力进行报道。
- 关望陈建平徐佳楠许颖
- 关键词：军团菌水环境系统发育学毒力
- 嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究被引量：4
- 2007年
- 目的构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1--pilE。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物。将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性。结果扩增出了429bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白。pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1(+)组(P<0.01)。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答。
- 杨志伟陈建平王涛田玉刘德松
- 关键词：嗜肺军团菌免疫原性体外表达
- 嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化被引量：2
- 2009年
- 目的扩增编码Ⅳ型菌毛蛋白的嗜肺军团菌pilE基因,构建重组质粒pET32a(+)-pilE并在原核系统中表达,纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE,为进一步探讨Ⅳ型菌毛蛋白的作用及其作为军团病的诊断抗原提供实验基础。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从嗜肺军团菌扩增得到pilE基因,构建重组质粒pET32a(+)-pilE,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用聚合酶链式反应、限制性酶切分析、序列分析鉴定后,IPTG诱导表达PILE蛋白,用硫酸十二烷酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹鉴定。使用HisTrapTMHP亲和层析柱纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。结果扩增出430bp的pilE基因;构建了重组质粒pET32a(+)-pilE;表达并纯化出35700Mr的目标蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的原核重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。成功纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。
- 徐佳楠陈建平
- 关键词：嗜肺军团菌纯化
- 嗜肺军团菌PAL抗原基因的克隆及真核表达被引量：2
- 2007年
- 目的构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌PAL基因,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,将经酶切、PCR扩增及序列测定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-PAL。脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞,经免疫荧光和RT-PCR检测其瞬时表达和稳定表达产物。结果重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞后获得了有效表达。结论成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL为嗜肺军团菌核酸疫苗的进一步研究奠定了基础。
- 田玉陈建平杨春蕾刘明杰
- 关键词：嗜肺军团菌PAL基因克隆基因表达
