河北省高等学校科学技术研究指导项目(ZH2012010)
- 作品数：7 被引量：34H指数：4
- 相关作者：张进顺张晓磊王春苗郭玲玲贾晓晖更多>>
- 相关机构：河北北方学院河北北方学院附属第一医院更多>>
- 发文基金：河北省高等学校科学技术研究指导项目河北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建被引量：2
- 2015年
- 目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分别经Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18重组质粒。经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒p VAX1-ROP18-ROP12转染至He La细胞。同时设空质粒组、p VAX1-ROP18转染组和p VAX1-ROP12转染组。提取各组He La细胞的总RNA并逆转录为c DNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12瞬时转染He La细胞后蛋白的表达情况。结果重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符。提取重组质粒经HindⅢ、Bam HⅠ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确。测序结果显示,p VAX1-ROP18-ROP12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100%,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99%。脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符。p VAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带。间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的He La细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光。Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000。结论构建了重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达。
- 郭玲玲张晓磊张进顺贾晓晖王春苗姜文静朱晓波贾天军
- 关键词：刚地弓形虫真核表达
- 刚地弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究进展被引量：9
- 2015年
- 弓形虫病一般采用药物治疗,但效果并不理想。目前,研制安全、有效的疫苗是弓形虫病防控的重要策略之一。核酸疫苗日益成为了研究的热点。棒状体蛋白(rhoptry proteins)是弓形虫在入侵宿主细胞过程中所分泌的,其通过与宿主相互作用帮助弓形虫逃避宿主的免疫攻击。研究表明其在弓形虫入侵宿主细胞、纳虫泡形成及胞内弓形虫的增殖调控方面发挥着重要作用,因此它成为了有潜力的疫苗候选抗原分子。本文就棒状体蛋白的特性、与宿主的相互作用及棒状体蛋白核酸疫苗候选分子方面的研究进展进行了综述。
- 郭玲玲张晓磊张进顺
- 关键词：刚地弓形虫相互作用核酸疫苗
- 弓形虫ROP11核酸疫苗免疫保护作用的研究被引量：7
- 2014年
- 目的观察ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法 40只BALB/c小鼠随机分为实验组、空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组,每组10只,均通过股四头肌注射免疫小鼠。其中实验组每鼠注射pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒100μg(1μg/μl),空质粒对照组注射pcDNA3.1(+)质粒100μg(1μg/μl),PBS对照组注射无菌PBS缓冲液100μl,空白对照组不注射。共免疫3次,每次间隔2周,末次接种量均加倍。分别于每次注射前和末次注射后第2周检测小鼠血清特异性IgG和细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。末次注射后2周各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×103个/只,观察其存活时间,评价免疫效果。结果 ROP11核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,实验组小鼠血清特异IgG随着免疫次数的增加而显著增高(P<0.05)。血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10均不同程度升高(P<0.05)。重组质粒免疫组、空质粒免疫组、PBS和空白对照组小鼠经RH株弓形虫攻击感染后的平均存活时间为236.3、97.8、96.3和96.2h,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠弓形虫感染有一定的免疫保护性,为进一步研究ROP11核酸疫苗的生物学功能提供了实验基础。
- 张晓磊张丽骞王春苗姜文静贾天军郭玲玲张进顺
- 关键词：刚地弓形虫核酸疫苗免疫保护
- 刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析被引量：21
- 2015年
- 目的对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18(TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增ROP18基因,并对其产物进行测序;采用在线生物软件预测TgROP18蛋白的结构与功能。结果 TgROP18基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小为1 665bp;测序分析显示,ROP18基因序列与GenBank上已发表的序列完全一致。TgROP18蛋白含有554个氨基酸,分子式为C2753H4405N801O811S20,分子质量单位为62.34ku,理论等电点为9.34;在TgROP18蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为41.52%、19.13%、7.76%和31.59%;TgROP18蛋白含有10个亲水性较高的区域(临界值为2.0),28个表面可及性较高的区域(临界值为1.9),10个保守结构区域,7个翻译后修饰位点,21个B细胞抗原表位,21个CTL抗原表位及26个Th抗原表位有。结论生物信息学分析表明,TgROP18蛋白具有良好的免疫原性,这将为弓形虫疫苗的研究提供基础资料。
- 郭玲玲张晓磊张进顺贾晓晖姜文静王春苗刘楠朱晓波
- 关键词：刚地弓形虫克隆真核表达质粒生物信息学分析
- 刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建被引量：7
- 2013年
- 目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。
- 张晓磊张进顺朱晓波王春苗贾晓晖贾天军徐云鹏高雪
- 关键词：刚地弓形虫真核表达质粒
- 刚地弓形虫ROP11基因的克隆及生物信息学分析被引量：3
- 2013年
- 提取刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）RH株速殖子总RNA，根据棒状体蛋白11（ROP11全长编码序列（登录号为DQ077905）的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR（RT-PCR）扩增，PCR产物经EcoRI和NotI酶切后与原核表达载体pGEX-6P-2连接，重组质粒转化大肠埃希菌（E．coli）XL-Blue，阳性菌落经PCR和双酶切鉴定，并测序。对所得序列进行生物信息学分析。结果显示，RT-PCR扩增产物约为1500bp。菌落PCR及双酶切结果正确。测序结果显示，获得的ROP11基因片段为1548bp（登录号为KC456639），与GenBank上已有的弓形虫ROP11序列相比，序列一致性为99％。生物信息学分析发现，ROP11编码蛋白质的预期相对分子质量为M57020，包括有12个保守结构区域，其前26个氨基酸残基构成信号肽，丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶催化区域位于170～511氨基酸，且有2个潜在的N-糖基化位点。
- 张晓磊张进顺贾晓晖徐云鹏张颖王春苗王燕卢致民赵建玲贾天军
- 关键词：刚地弓形虫原核表达生物信息学分析
- 刚地弓形虫P30基因的克隆及编码蛋白结构与抗原表位的生物信息学分析被引量：1
- 2023年
- 目的克隆刚地弓形虫P30基因,从生物信息学角度分析P30基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。方法提取刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子总RNA,进行RT-PCR扩增,扩增产物经NheI和AflⅡ双酶切后与真核表达载体PVAXI连接,转化后通过菌落PCR、双酶切和测序鉴定。使用Protparam、Protscal、SOSU、SWISS-MODEL、SOPMA、Bcepred和TMHMM等在线分析工具,分析P30蛋白的物理和化学性质、亲水性、疏水性、二级结构、表面可及性、柔韧性、细胞定位、跨膜结构域、信号肽、翻译后修饰位点、结构域、功能域、抗原表位和三级结构。结果RT-PCR扩增大小为789 bp,菌落PCR显示,在约789 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符,阳性PVAXI-P30重组质粒经Nhel和AflⅡ双酶切获得大小为789 bp和3000 bp的两条条带,大小与目的基因和载体片段相等,测序结果显示,P30基因大小为789 bp,与GenBank的P30基因(登录号为X14080.1)核苷酸序列一致性为100%。P30蛋白含有336个氨基酸,分子式为C_(1525)H_(2459)N_(409)O_(477)S_(21),相对分子质量为34.83×10^(3),理论等电点(8.34),不稳定指数(36.70),脂溶性指数(80.15),消光系数(20970),A_(280)(0.602),P30亲水性氨基酸分布在整条链上,具有两亲性,在P30蛋白的336个氨基酸中,α-螺旋(Hh)占22.32%,β-折叠(Ee)占26.49%,β-转角(Tt)占8.04%,无规则卷曲(Cc)占43.15%,表面可及性参数得分≥1.9的区域是11个,柔韧性参数得分≥2.0的区域和亲水性参数得分≥1.9的区域均有6个,翻译后修饰位点有6个,保守结构域有5类,潜在B细胞抗原表位共13个,8个潜在限制性CTL细胞抗原表位,13个潜在辅助T细胞抗原表位,P30蛋白最有可能是定位于真核细胞线粒体内的可溶性表达蛋白。结论刚地弓形虫P30基因编码的蛋白为可溶性表达蛋白,具有免疫原性,可为弓形虫病疫苗的研制提供理论基础。
- 张晓磊赵利娜郭坦达贾久祺薛锰韩新年刘哲张进顺
- 关键词：刚地弓形虫P30克隆蛋白结构抗原表位
