国家科技重大专项(2009ZX08007-009B)
- 作品数：8 被引量：12H指数：2
- 相关作者：雷明成鹰王凤阳张冬琳杜丽更多>>
- 相关机构：海南大学华中师范大学山东省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 cDNA的克隆与原核表达被引量：2
- 2012年
- 本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)基因,并用West-ern blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。
- 焦寒伟王洪梅刘晓杜丽雷明张冬琳郝永昌成鹰何洪彬王凤阳
- 关键词：中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2克隆原核表达
- 水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达被引量：5
- 2011年
- 采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88(mydoid differentiation factor88,MyD88)cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。
- 张晓茹匡文华成鹰杜丽张冬琳郝永昌雷明焦寒伟刘涛祁超王凤阳
- 关键词：MYD88水牛基因克隆原核表达
- 水牛MD-2 cDNA基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2011年
- 为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定。采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28a-bMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,bMD-2基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;37℃条件下,经1 mmol/LIPTG诱导表达6 h后,His-bMD-2在E.coliBL21中表达量最高,并以包涵体的形式存在,融合蛋白的分子质量约为25 ku。结果表明水牛MD-2原核表达载体成功构建并表达,为继续深入对水牛MD-2基因功能的研究提供参考。
- 焦寒伟杜丽雷明张冬琳郝永昌张晓茹匡文华成鹰王凤阳
- 关键词：水牛MD-2克隆原核表达
- 水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达被引量：1
- 2012年
- 将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Westernblotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。
- 匡文华张晓茹成鹰杜丽雷明焦寒伟张冬琳郝永昌祁超王凤阳
- 关键词：水牛髓样分化因子88EGFP融合蛋白真核表达
- 水牛TLR2cDNA的克隆与生物信息学分析被引量：3
- 2011年
- 本研究通过RT-PCR分段扩增得到水牛Toll样受体2(TLR2)cDNA序列,并利用亚克隆重叠区进行全长序列拼接。将拼接产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析。结果表明,克隆得到的序列全长2 455bp,含有一个大小为2 355bp的开放阅读框,共编码784个氨基酸,分子质量为90.2ku,理论等电点为6.92;TLR2ORF序列与GenBank上登载的水牛核苷酸序列同源性为99.53%,与黄牛、马、人、黑猩猩和狗的核苷酸序列同源性分别为97.88%、84.94%、83.12%、82.95%和82.74%,具有很高的相似性;该蛋白是一个跨膜蛋白,存在LRR、LRR-TYP、LRRCT及TIR结构域,与Toll样受体家族成员的共同结构相一致。水牛TLR2基因的成功克隆及序列分析和结构预测为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 张晓茹匡文华成鹰杜丽张冬琳郝永昌雷明刘涛焦寒伟王凤阳祁超
- 关键词：TOLL样受体2水牛分子克隆生物信息学分析
- 水牛Cdc42 cDNA的克隆与生物信息学分析
- 2011年
- 通过RT-PCR扩增得到水牛细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)cDNA序列,将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序并进行生物信息学分析。结果表明:克隆得到的序列全长626bp,含有1个大小为576bp的开放阅读框,共编码191个氨基酸,相对分子质量为21.3×103,理论等电点为6.16;Cdc42ORF序列与Genbank上登载的黄牛、狗、小鼠和人的核苷酸序列同源性分别为99.65%、96.70%、94.97%和94.10%,具有很高的相似性;该蛋白为非跨膜蛋白,存在1个RHO结构域。
- 张晓茹匡文华成鹰杜丽雷明焦寒伟张冬琳郝永昌祁超王凤阳
- 关键词：CDC42水牛基因克隆生物信息学分析
- 水牛CD14 cDNA的克隆、表达及鉴定
- 2011年
- 目的:克隆水牛白细胞分化抗原14(buffalo cluster of differentiation antigen14,bCD14)基因,表达bCD14蛋白,并进行Western Blot鉴定。方法:采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bCD14基因,构建重组质粒pET28a-bCD14,转化入Ecoli BL21,IPTG诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析及Western blot鉴定。结果:bCD14基因含有一个1 122bp的开放阅读框,编码373个氨基酸;与印度水牛、挪威大鼠和人CD14的cDNA序列同源性分别为97.95%、68.78%、78.60%,氨基酸同源性分别为96.78%、61.27%、72.34%;主要以包涵体形式表达,表达蛋白经Western Blot鉴定,得到了一条约46 kD的特异性条带。结论:该文成功克隆了bCD14基因,表达了bCD14蛋白,为进一步揭示水牛抵抗革兰氏阴性菌感染的免疫机制奠定了基础。
- 陈品林杜丽雷明成鹰陈兴生莫蘼刘涛张冬琳崔森王凤阳
- 关键词：水牛CD14克隆纯化
- 水牛TLR4 cDNA全长的克隆及其生物信息学分析
- 2011年
- 本研究利用RT-PCR方法分段克隆水牛TLR4 cDNA后拼接成全长,并克隆于pMD20-T载体中,同时运用生物信息学软件对其核苷酸序列及编码蛋白质的结构进行分析和预测。结果表明,克隆的TLR4 cDNA ORF全长2526 bp,共编码841个氨基酸,N端具有由25个氨基酸组成的信号肽,该蛋白预测的分子质量为95.98 ku,等电点为6.37;水牛TLR4与GenBank中登录的水牛TLR4(DQ857349)核苷酸序列同源性达99.01%,与黄牛、绵羊、野猪、马、人和黑猩猩的同源性超过80%,与小鼠和狗的同源性次之,分别为72.17%和61.30%,与鸡的最低,仅为53.94%;该蛋白是由胞外区(1-634位氨基酸)、跨膜区(635-657位氨基酸)和胞内区(658-841位氨基酸)3部分构成的跨膜蛋白,胞外区含有12个LRR串联重复结构域、胞内区具有TIR结构域。本试验成功克隆了水牛TLR4 cDNA全长,并获得了核苷酸及其蛋白质的生物信息学分析数据,为进一步研究其功能奠定了基础。
- 匡文华张晓茹成鹰杜丽张冬琳郝永昌雷明焦寒伟刘涛祁超王凤阳
- 关键词：水牛CDNA克隆生物信息学分析
