江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目(2007038)
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 相关作者：钱进军马瑞高静熊御云赵康仁更多>>
- 相关机构：江苏大学江苏大学附属四院镇江市第四人民医院更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 胞质定位和核定位突触核蛋白慢病毒表达载体的构建被引量：1
- 2011年
- 目的:构建表达人突触核蛋白(α-synuclein)核定位和胞质定位基因(SNCA-NLS和SNCA-NES)的真核细胞表达慢病毒载体,并且观察重组质粒在293FT细胞中的表达情况。方法:采用PCR方法从质粒中扩增出目的基因,扩增出的目的基因与线性化后的载体PLVU-2A-EGFP在In-fusion重组酶作用下通过同源重组把目的片段连接到空载体上。目的片段和EGFP报告基因之间通过自剪切多肽2A连接。对重组质粒进行PCR、双酶切和质粒测序鉴定后,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组的质粒转染至293FT细胞中,用荧光显微镜检测基因在细胞中表达的情况。通过蛋白质印迹分析核定位和胞质定位基因(SNCA-NLS和SNCA-NES)在胞核和胞质中突触核蛋白的定向表达。结果:PCR、双酶切和质粒测序结果证明SNCA-NLS和SNCA-NES已正确地克隆到真核表达载体PLVU-2A-EG-FP中,并分别在细胞核和细胞质中定向表达。结论:成功构建了PLVU-SNCA-NLS-2A-EGFP及PLVU-SNCA-NES-2A-EGFP表达载体,为研究α-突触核蛋白在帕金森病发病过程中所起的作用奠定了基础。
- 徐敏芳钱进军高静马瑞赵康仁
- 关键词：慢病毒载体
- 胞质和核定位α-突触核蛋白过表达对人神经母细胞瘤细胞的影响被引量：3
- 2013年
- 探讨α-突触核蛋白在人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞中定位过表达的影响.研究应用PLVU-SNCA-NES(NLS)-2A-EGFP重组慢病毒载体感染SH-SY5Y细胞,通过观察绿色荧光蛋白(EG-FP)检测目的基因在细胞中的表达情况.形态观察与MTT检测相结合,分析胞质和核定位α-突触核蛋白过表达对SH-SY5Y细胞增殖的影响,同时测定鱼藤酮、H2O2对胞质和核定位α-突触核蛋白过表达SH-SY5Y细胞活性的影响.MitoTracker染色法测定胞质和核定位α-突触核蛋白过表达的SH-SY5Y细胞中线粒体数目的变化.结果发现,α-突触核蛋白胞质定位过表达使得SH-SY5Y细胞培养96h时活性显著增强,24h、48h、96h时细胞中线粒体的数目显著增加,增长比率分别为91.18%、41.15%、50.21%;α-突触核蛋白核定位过表达的SH-SY5Y细胞相对正常细胞表现出较低的细胞活性,在培养48h、72h后细胞存活率显著下降.400nmol/L鱼藤酮损伤24h后,α突触核蛋白核定位过表达的SH-SY5Y细胞活性显著高于正常细胞鱼藤酮损伤组.50～800μmol/LH2O2处理条件下,α-突触核蛋白的定位过表达对SH-SY5Y细胞活性的影响并不显著.研究结果表明α-突触核蛋白胞质定位过表达表现出一定的神经保护作用,α-突触核蛋白核定位过表达也能使SH-SY5Y细胞的活性发生改变.
- 夏娟高静熊御云邱晶马瑞钱进军
- 关键词：Α-突触核蛋白核定位
- 突变A53Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析
- 2011年
- 目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞。方法:PCR扩增法获得含有SalI和NotI的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,SalI、NotI双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES。重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞。结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达。结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一。
- 王颖钱进军赵康仁马瑞徐敏芳熊御云高静
