甘肃省科技支撑计划(0708NKCA079)
- 作品数：7 被引量：27H指数：3
- 相关作者：魏锁成巩转娣宋昌军田风林韦敏更多>>
- 相关机构：西北民族大学兰州百源基因技术有限公司更多>>
- 发文基金：甘肃省科技支撑计划甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 仔猪轮状病毒FQ-PCR检测方法的建立被引量：3
- 2010年
- 目的探讨动物轮状病毒分离鉴定方法 ,建立实时荧光定量PCR(FQ-PCR)快速检测法。方法用RV敏感的MA-104细胞分离病毒,测定其VP6基因序列和同源性分析,建立FQ-PCR检测方法。结果 MA-104细胞接毒并传代18h后出现明显的细胞病变(CPE),分离到1株猪轮状病毒(PRV),经RT-PCR扩增得到1200bp的VP6片段,与标准株(AV-55)的同源性达88.50%;且建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度比普通PCR高数十倍,具有较强的特异性。结论建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度和特异性比普通PCR高数十倍,PRV的VP6与参考株具有88.50%同源性,建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度和特异性普通PCR和ELISA均高。
- 魏锁成巩转娣宋昌军
- 关键词：轮状病毒实时荧光定量PCR仔猪
- 牛轮状病毒的分离与细胞培养特性被引量：4
- 2010年
- 探讨牛轮状病毒(BRV)的细胞培养方法,为研发诊断试剂盒和疫苗提供依据.将RT-PCR阳性样品在MA-104细胞及Vero细胞上进行培养,盲传4代后MA-104细胞出现病变(CPE),主要表现为细胞脱落,出现拉网现象,部分出现死亡.这表明轮状病毒能够在MA-104细胞上生长,并引起细胞病变;而Vero细胞无病变.用胰酶处理的病毒接种MA-104细胞,用含2μg/mL、3μg/mL和5μg/mL三种(A、B和C)不同浓度胰酶的培养液在MA-104和Vero细胞对犊牛轮状病毒传代培养.将分离培养的病毒经聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明BRV在C组培养液中分离培养最好,聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示病毒核酸呈4∶2∶3∶2排列,与参考株NCDV相似,呈典型A群轮状病毒的特征.
- 魏锁成冯若飞巩转娣田风林
- 关键词：轮状病毒细胞病变胰酶
- 牛轮状病毒VP7基因荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：3
- 2013年
- 为建立快速特异的定量检测牛轮状病毒(BRV)VP7基因的荧光定量PCR检测方法,本研究设计扩增BRV VP7基因的特异性引物,将扩增的VP7基因片段(342 bp)克隆于pMD18-T载体中(pMD-VP7),作为重组质粒标准品,建立EvaGreen荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法。经反应条件优化,结果表明该方法的最低检测量为8.03拷贝/μL。该方法对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复变异系数均小于3%。采用该方法对12份ELISA阳性样本检测出10份阳性,符合率83.33%。本研究建立的BVR VP7 qRT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和对标本的检测能力较强等特点,可以用于临床诊断和流行病学调查。
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- 关键词：轮状病毒VP7基因实时荧光定量PCR
- 猪轮状病毒的细胞培养特性研究被引量：1
- 2009年
- 目的:探讨动物轮状病毒细胞培养的特性和适宜条件,为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。方法:制备三种细胞培养液(A、B、C组),经对MA-104细胞培养,确定最适培养液,高倍光镜下观察细胞形态的变化。结果:MA-104细胞用含10%小牛血清加高糖DMEM的培养液(C组)培养时贴壁较快,生长良好,成本较低。传代18h后出现明显的细胞病变(CPE),细胞膜缩融合、细胞层裂开、出现细胞核固缩,空泡化、染毒的细胞出现大片脱落区域,最后细胞死亡脱落,随传代次数增加,病变程度加深,CPE出现时间加快。没有脱落的细胞出现拉网现象。当CPE达到90%的时候开始收毒。结论:PRV在MA-104细胞中能良好生长,培养的最佳条件为37℃5%CO2,2-3d,传代18h后出现CEP,随传代次数增加,病变程度加深。
- 魏锁成巩转娣宋昌军
- 关键词：轮状病毒细胞培养
- 猪轮状病毒的细胞培养特性与FQ-PCR检测方法的建立被引量：4
- 2011年
- 为了探讨动物轮状病毒的细胞培养特性和分离方法,建立FQ-PCR检测方法,旨在为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。37℃5%CO_2下用细胞培养液C培养ELISA检测的阳性猪粪便样本,观察细胞形态的变化;用RV感染MA-104细胞,分离纯化病毒,测定VP6基因序列并分析其同源性,在普通PCR和实时定量PCR的基础上,建立FQ-PCR检测方法。结果,MA-104细胞培养的最佳条件为37℃5%CO_2;接毒后18 h出现细胞膜缩融合、细胞层裂开、细胞核固缩及空泡化等明显的细胞病变(CPE),CPE达到90%时可收毒;分离到1株猪轮状病毒(暂命名为GSPRV01株),得到VP6为1 200 bp,与标准株(AV-55)的同源性为88.50%。
- 魏锁成巩转娣宋昌军
- 关键词：轮状病毒实时荧光定量PCR
- 犬轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：3
- 2009年
- 目的:建立轮状病毒快速准确的检测方法,为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。方法:用Primer5软件设计VP7引物,从采集的腹泻犬粪便样品抽提病毒RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,将RNA反转录为cDNA,并进行PCR扩增,对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序,与代表株的VP7进行同源性比较。结果:从腹泻病犬粪便样品中抽提到了轮状病毒RNA,反转录后扩增产物为51bp的基因片段,经核苷酸序列分析,其PCR序列与犬轮状病毒VP7基因编码源序列的同源性为86.3%。结论:正确克隆了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区,建立了犬轮状病毒实时定量诊断方法,为研制实时定量诊断试剂盒奠定了基础。
- 魏锁成何丽
- 关键词：轮状病毒VP7RT-PCR实时荧光定量PCR
- 奶牛血清中Zn、Fe与LH、FSH浓度的相关性分析被引量：9
- 2010年
- 本试验用原子吸收光谱法(AAS)和ELISA法分别测定了48头奶牛血清中Zn、Fe含量和促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)的浓度。结果表明,不同年龄奶牛血清Zn和Fe含量以7岁和5岁为最高;LH以4岁为最高(P<0.01),FSH至4岁是最低(P<0.01),然后升高;Zn与FSH、Fe与LH和FSH均呈负相关(P>0.05);这些都和回归方程中截距A的正负号是完全一致的,同一种激素与不同元素回归方程的截距和回归系数均明显不同。可以得出不同年龄奶牛血清激素和微量元素含量变化较大,微量元素和激素间存在明显的相关性。
- 韦敏魏锁成
- 关键词：LHFSH年龄奶牛
