云南省应用基础研究计划面上项目(2011FB116)
- 作品数：8 被引量：42H指数：2
- 相关作者：李琦涵张莹刘龙丁王丽春董承红更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院中国医学科学院昆明医科大学更多>>
- 发文基金：云南省应用基础研究计划面上项目国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)毒种FY23-KB株的遗传稳定性被引量：2
- 2014年
- 目的 探讨肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）灭活疫苗（人二倍体细胞）毒种FY23-KB株在KMB-17细胞中连续传代的遗传稳定性。方法 比较疫苗株FY23-KB在Vero细胞中生长的第2代（FY23-V-2）与在KMB-17细胞中适应性生长的第12（FY23-KB-12）、14（FY23-KB-14）、16（FY23-KB-16）代,以及FY23-KB-14与在KMB-17细胞中适应性生长的第19（FY23-KB-19）、20（FY23-KB-20）、21（FY23-KB-21）代的VP1区序列及毒力变化情况,分析该疫苗株的遗传稳定性。结果 与在Vero细胞上分离的原始毒株FY23-V-2相比,在KMB-17细胞中适应性生长的FY23-KB株的原始种子（第12代）、主种子（第14代）和工作种子（第16代）的VP1区序列出现了3个碱基突变,引起2个氨基酸改变,分别为VP1的第226位的Ser突变为Pro和第282位的Asn突变为Asp;与第14代基因序列相比,第19、20、21代的VP1区序列,分别有6、8和11个碱基突变,其中大部分为无意义突变,仅在第21代出现了两个位点（P134和P230）的氨基酸改变;所有代次的病毒滴度均维持在6.5～7.0 lgCCID50/ml。结论EV71灭活疫苗（人二倍体细胞）毒种FY23-KB株在KMB-17细胞中连续传代,VP1序列未发生明显变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性,从分子水平证明了该疫苗的安全性。
- 张莹赵红玲王丽春刘龙丁董承红李琦涵
- 关键词：肠道病毒71型
- 两株不同表型的CA16毒株(B基因型)的生物学性状比较分析被引量：1
- 2012年
- CA16病毒作为手足口病主要病原之一,其病原学性状与感染引起的病理过程具有可能的相关意义.对分离自一名重症手足口病(HFMD)患者咽拭子的两株呈现不同蚀斑形态的CA16毒株所做的生物学分析表明,它们在增殖动力学、免疫原性等生物学性状上的差异与其对乳鼠致病能力的差异具有相关性,而这些共同的差异与病毒基因非编码区5′端序列及结构区的VP1区域中的序列之间存在着可能的对应关系,所有这些结果提示了CA16病毒生物学及遗传学性状与其致病能力的相关性.
- 杨二霞赵恒张莹刘建生廖芸王丽春崔萍芳杨丽仙刘龙丁董承红董少忠邵聪文姜莉孙乐李琦涵
- 关键词：增殖动力学免疫原性
- α突触核蛋白作用核苷酸序列的体外筛选研究
- 2014年
- 目的体外筛选α突触核蛋白可能作用的核苷酸序列。方法根据碱基组成特征合成一系列的核苷酸序列,与α突触核蛋白-绿色荧光蛋白(α-synuclein-green fluorescent protein,α-syn-GFP)融合蛋白混合,采用圆二色谱分析色谱峰的变化情况。结果α突触核蛋白-绿色荧光蛋白融合蛋白混合入GC-box样核苷酸序列后导致色谱峰发生较大变化。结论α突触核蛋白转位进入细胞核后,可能通过作用于GC box样核苷酸序列,参与细胞核内的基因表达调控,从而发挥其生理或病理作用。
- 马开利宋连昆苑玉和张莹李莉杨金玲朱平陈乃宏
- 关键词：Α突触核蛋白核苷酸序列圆二色谱核定位帕金森病
- EV71可感染幼龄中缅树鼩被引量：27
- 2012年
- 树鼩是灵长类动物的近亲,且具有体型小、繁殖周期短、饲养管理成本低等优点,长期以来被认为有望替代灵长类动物用于人类疾病的动物模型研究。该文研究了肠道病毒EV71对幼年中缅树鼩的感染特点,探索建立EV71感染树鼩动物模型及替代灵长类动物的可行性。实验分别采用灌胃、滴鼻和尾静脉注射3种方式,感染3月龄树鼩,定期观察动物临床症状和血常规变化和定期采集血液和粪便样品,并使用中和抗体试验、reverse transcription-PCR(RT-PCR)和Real-TimePCR等技术,检测相关样品中和抗体效价、病毒核酸及载量变化。结合组织病理学检查,分析感染病变特点。研究结果发现,实验组树鼩体温在第4天前后开始升高,白细胞、淋巴细胞也有类似趋势;3种攻毒方式均可检测到病毒载量,峰值出现在第10天前后,灌胃途径尤为明显,血清的最大中和抗体效价为1:16。感染EV71病毒的树鼩2周左右出现急性松弛性瘫痪,大体解剖发现伴有尿潴留症状,组织病理学检查发现在脑、肺、肠、脾脏、肾脏等部位发生病变。结果表明,EV71病毒通过灌胃、滴鼻和静脉注射3种方式均可以感染中缅树鼩,并使之出现神经系统及相关病变,该实验为将来研究EV71感染树鼩致病机理、建立手足口病树鼩动物模型奠定了理论基础。
- 王文广黄晓燕徐娟孙晓梅代解杰李琦涵
- 关键词：手足口病EV71中缅树鼩动物模型
- 肠道病毒71型灭活疫苗热稳定性研究被引量：2
- 2014年
- 目的 研究肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗（人二倍体细胞）生产过程中的中间产品及成品的热稳定性.方法 将不同批次EV71灭活疫苗的病毒收获液、疫苗原液以及疫苗成品分别置于不同温度保存.第0、6、12、24个月时选取存放于-20℃、4℃的病毒收获液及-20℃的疫苗原液的样品,第0、1、3、6、12个月时选取存放于4℃的疫苗原液的样品,第0、6、12、24个月时选取存放于4℃的疫苗成品的样品,第0、7、14、28、42、60天时选取存放于25℃的疫苗成品的样品,第0、3、7、14、21天时选取存放于37℃的疫苗成品的样品,检测样品的病毒感染性滴度（lgCCID50/ml;CCID50,cell culture infective dose 50％,细胞培养半数感染量）、抗原含量、内毒素含量、pH值等;对1 800只BLAB/c小鼠进行疫苗成品的腹腔免疫注射,同时针对每个温度下不同保存时间设立对照组,每组10只小鼠（注射无病毒抗原的稀释液）,共150只.接种4周时每只小鼠采集尾静脉血500μl,检测血清的中和抗体效价,计算疫苗成品的半数有效量（ED50）.采用随机区组方差分析,对不同温度下,不同保存时间的各项指标进行比较.结果 EV71灭活疫苗的病毒收获液在-20℃条件下,保存0、6、12、24个月时病毒滴度分别为（6.67 ±0.13）、（6.56±0.09）、（6.52±0.04）、（6.39±0.16） lgCCID50/ml;4℃条件下,各时间点的病毒滴度分别为（6.67 ±0.13）、（6.41±0.13）、（6.19 ±0.18）、（5.97±0.09） lgCCID50/ml,均随保存时间的延长呈下降趋势（F值分别为9.81和44.16,P值均＜0.05）.疫苗原液在4℃条件下,保存0、1、3个月时的抗原含量均为（3 626.67±1 382.56） EU/ml,保存6和12个月时分别为（2 080.00±876.36）、（951.17±346.35） EU/ml.疫苗成品在4℃条件下,保存0、6、12、24个月时的效力分别为（31.00±2.71）、（32.93±3.22）、（39.37±3.44）、（46.04±3.25） EU/ml;在25℃条件下,保存0、7、14�
- 张莹李琦涵廖芸刘龙丁李海巍董承红
- 关键词：人二倍体细胞热稳定性
- 肠道病毒71型灭活疫苗的规模化制备和免疫原性研究被引量：8
- 2012年
- 目的规模化制备3批肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞),研究其免疫原性。方法在人二倍体细胞上适应的EV71毒株经灭活、纯化后,制备成为EV71灭活疫苗成品。采用0、4周2针程序,皮下注射免疫恒河猴,于第2次免疫后2、4～72周取外周静脉血分离血清进行中和抗体测定,同时于第2次免疫后8周时取外周静脉血采用γ干扰素酶联免疫斑点(IFN-γELIspot)方法检测细胞免疫应答。通过EV71毒株颅内注射乳鼠的研究方法,获得乳鼠攻毒的半数致死量(LD50),按5倍LD50对疫苗免疫母鼠所生的乳鼠攻毒,评价疫苗的动物保护效果。结果 EV71灭活疫苗免疫恒河猴后,2针免疫后2周即可诱导中和抗体的产生,其抗体水平可达到1∶32,在2针免疫后72周时中和抗体水平仍能维持在1∶16～1∶32;于2针免疫后第8周取血,疫苗组诱导产生IFN-γ斑点数[250斑点形成细胞(SFC)/1×106外周血单核细胞(PBMCs)]显著高于接种生理盐水的对照组(16SFC/1×106 PBMCs),P<0.01。EV71疫苗对小鼠—乳鼠免疫的保护性研究结果表明,接种EV71疫苗后,在5倍LD50攻毒情况下,对乳鼠的保护率达到100%。结论规模化生产制备以人二倍体细胞作为细胞基质的EV71疫苗,具有较好的免疫原性。
- 梁燕赵红玲刘龙丁廖芸董承红纳锐雄张莹王晶晶王丽春李琦涵
- 关键词：免疫原性
- EV71两种结构形式的免疫学特性比较被引量：1
- 2014年
- 目的分析肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）在病毒增殖的动力学过程中不同时间点的病毒样品所具有的两种结构形式及免疫学特性,为疫苗的研发及质控提供参考。方法利用Opti Prep密度梯度离心获得EV71两种结构形式,电镜扫描观察两种结构形式的颗粒形态;采用病毒微量滴定法测定病毒两种结构形式的感染性滴度;EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫（BA-ELISA）方法测定病毒两种结构形式的抗原含量;QRT-PCR法测定两种结构形式的病毒RNA含量;SDS-PAGE及Western blot鉴定病毒两种结构形式。将分离得到的空壳及实心病毒颗粒成分用甲醛灭活后,与Al（OH）3佐剂混合,对小鼠进行皮下多点注射,分别于初免28 d及二免7、14 d,经小鼠尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验法检测抗EV71中和抗体;将二免14 d后的雄、雌鼠合笼,生产后24 h内,用EV71FY-23对乳鼠进行颅内注射,10 d内观察乳鼠存活率。结果经Opti Prep密度梯度离心后,可获得两条沉降系数不同的病毒条带,位于上层的病毒结构成份基本以空心衣壳颗粒形式存在;下层病毒结构成分在感染前期主要为以实心颗粒形式存在,感染后期则以空壳和实心颗粒同时存在,两种结构形式均能被抗EV71特异血清识别。在病毒感染过程中,下层毒粒感染性滴度均比上层毒粒高2~3个log值;两种结构形式的抗原滴度均呈增加的趋势,但下层毒粒抗原滴度增加更为明显;病毒两种结构形式两层的RNA含量不同,下层毒粒中VP0均已裂解形成VP2和VP4,而上层毒粒中以VP0为主要成分。初免后28 d及二免后7、14 d,两种结构形式的EV71均诱导小鼠抗体阳转,但上层毒粒诱导的中和抗体效价及增长速度均明显低于下层毒粒（P均〈0.001）。病毒两种结构形式免疫小鼠产生的乳鼠免疫保护效率均为100%。结论 EV71的两种结构形式虽然具有差异,但作为病毒疫苗抗原用于免疫时,均
- 程晨冯敏杨二霞普晶崔萍芳张莹李建平陈姝樾王丽春赵树栋王晶晶李剑兰刘龙丁李琦涵
- 关键词：肠道病毒71型结构形式免疫学特性
- RNAi技术对EV71病毒感染恒河猴星状胶质细胞所需细胞磷酸酶谱的分析被引量：1
- 2013年
- 肠道病毒71型(EV71))已被证明是引起近年来亚洲-太平洋地区频发的手足口病重症并导致患者死亡的最主要病原体.但是,其是如何感染神经系统并导致严重神经系统病理损伤的分子机制尚不明确.在前期针对EV71感染星状胶质细胞的研究工作基础上,本研究利用针对恒河猴细胞内磷酸化/去磷酸化系统的共212个磷酸酶基因的siRNA库,分别下调了分离自恒河猴大脑并经纯化培养的星状胶质细胞内相应的磷酸酶的表达,并在此背景条件下比较了EV71在该细胞中的增殖特征,并对若干可以通过其表达水平及其活性的变化而直接影响EV71增殖的磷酸酶做了进一步分析.结果表明,恒河猴星状胶质细胞中若干与调控信号通路相关的酪氨酸磷酸酶和丝/苏氨酸磷酸酶对EV71的增殖具有调控作用,而病毒亦可能通过与这些磷酸酶的相互作用对所感染的星状胶质细胞的免疫反应性产生相应的影响.
- 郭素杰马娜岳磊张莹刘龙丁王晶晶廖芸赵红玲纳锐雄李昭李琦涵
- 关键词：小干扰RNA星状胶质细胞磷酸酶
