国家自然科学基金(NSFC30771885)
- 作品数：6 被引量：16H指数：3
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- 旋毛虫p46000抗原基因的转录及表达特性鉴定被引量：5
- 2009年
- 根据旋毛虫p46000抗原基因和葡萄糖3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列设计特异引物,以不同发育时期旋毛虫总RNA为模板进行SYBRGreen染料法实时定量RT-PCR检测p46000基因转录情况。制作不同发育时期旋毛虫虫体及感染组织石蜡切片,采用免疫荧光染色技术检测p46000抗原的表达及定位情况。结果显示,p46000抗原基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,转录高峰集中于成虫和肌幼虫期,新生幼虫期明显低于其他时期。天然p46000抗原蛋白定位于杆状体和虫体表面,表达高峰集中于成虫、肠道期及成囊期肌幼虫。表明,p46000抗原基因的转录与表达具有一定的时空特异性,该基因在旋毛虫的寄生过程中尤其在早期感染中具有重要作用且可能与旋毛虫的免疫逃避有关。
- 于申业吴秀萍王学林于录王心蕊杨勇冯晓静刘明远
- 关键词：旋毛虫实时定量RT-PCR免疫荧光
- 旋毛虫T626-55基因减毒沙门氏菌疫苗的构建及其在小鼠体内表达被引量：1
- 2011年
- 采用PCR方法扩增旋毛虫强反应原性基因T626-55,与真核表达载体pcDNA3.1相连,构建携带编码旋毛虫T626-55基因真核表达质粒的沙门氏菌,将构建好的重组质粒T626-55-pcDNA3.1通过电穿孔转化入沙门菌中。小鼠口服免疫该重组沙门菌,5 d后通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光(IFA)检测目的基因在小鼠组织内的转录和表达情况。结果表明:成功构建含有目的基因真核表达质粒的沙门菌T626-55-pcD-NA3.1-PQ,通过口服免疫该菌,在小鼠脾脏及派伊尔氏结(PP)内检测到目的基因的转录,在脾脏内检测到目的基因表达。
- 杜婧刘攀唐斌高鹤刘明远
- 关键词：旋毛虫沙门氏菌反转录PCR间接免疫荧光
- 旋毛虫脱氧核糖核酸酶-Ⅱ酶活及酶活性位点的鉴定被引量：3
- 2010年
- 以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH 8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸(H),而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。
- 吴秀萍于录王学林龙明慧Boireau P刘明远
- 关键词：旋毛虫酶活性活性位点
- 旋毛虫Serpin基因的体外表达及其特性鉴定被引量：7
- 2009年
- 目的体外表达旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serpin)基因,并检测其在旋毛虫不同发育时期mRNA转录、蛋白表达与分子定位及反应原性情况,为以其作为候选诊断抗原基因提供实验依据。方法根据旋毛虫Serpin基因序列,以重组质粒pBlue-script-WM5为模板,利用PCR技术去除其全长cDNA的信号肽序列,采用原核表达载体pET-28a构建不含该基因信号肽的、融合蛋白不含组氨酸标签的重组表达质粒pET-28a-WM5,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物纯化后,采用Westernblot法检测反应原性。免疫组织化学技术检测Serpin蛋白在旋毛虫不同发育时期的表达及定位情况。采用RT-PCR和实时定量RT-PCR技术检测Serpin基因在旋毛虫不同发育时期的转录水平。结果重组质粒pET-28a-WM5经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,Serpin基因能够在大肠杆菌中高效表达。重组蛋白主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的51.1%。纯化后的重组蛋白纯度可达98%,与猪抗旋毛虫60d抗血清有较好的反应原性,与26d猪抗血清无明显反应信号;RT-PCR与实时定量RT-PCR结果显示,该基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,有2个转录高峰期(Ad2/Ad3和ML)以及1个转录水平明显下降期(Ad5);免疫组化鉴定表明,Serpin天然抗原在旋毛虫肌幼虫时期18d开始表达,且在感染35d后大量表达和分泌。结论已获得较高纯度的旋毛虫Serpin体外表达融合蛋白,其具有较好的反应原性。旋毛虫Serpin基因具有期特异性表达的特点,且在肌幼虫期具有高转录与高表达水平,可作为捕获旋毛虫肌幼虫期循环抗体的候选诊断抗原基因。
- 吴秀萍于申业刘相叶王学林杨勇王子见夏慧卿邓洪宽Boireau P刘明远
- 关键词：旋毛虫
- 旋毛虫新生幼虫DNA结合相关蛋白基因的筛选与分析被引量：1
- 2009年
- 目的筛选旋毛虫新生幼虫表达的可与宿主肌细胞染色体DNA结合的相关蛋白基因,寻找旋毛虫侵入及寄生过程中与宿主肌细胞发生结合的相关蛋白,为研究寄生虫与宿主间的信号转导、侵袭及长期寄生机制奠定基础。方法利用噬菌体展示技术构建旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库,用小鼠肌肉染色体DNA对展示文库进行筛选,随机挑选30个阳性克隆,进行PCR鉴定、测序分析和编码蛋白二级结构及翻译后修饰预测。结果旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库的原始文库库容量为2×105pfu,重组率为98%,95%的插入片段长度在250～2000bp之间,扩增后文库滴度为3×1012pfu/ml。对经4轮筛选后的克隆进行PCR鉴定及测序,获得13个基因序列,其中有4个(DN14、DN24、DN9及DN23)为旋毛虫新生幼虫DNA结合相关蛋白基因,分别与旋毛虫未知蛋白及假定ORF11.30、旋毛虫nudix水解酶及血吸虫SJCHGC05997蛋白、秀丽新杆线虫未知蛋白和旋毛虫TGF-β配基具有同源性。经编码蛋白质二级结构及翻译后修饰预测,这4种蛋白可能与旋毛虫包囊形成和寄生虫与宿主间信号转导有关。结论已成功构建了旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库,并利用小鼠肌肉染色体DNA筛选出4个可用于研究旋毛虫包囊形成及与宿主间信号转导机制的候选基因。
- 吴秀萍邓洪宽刘相叶于录王学林Boireau Pascal刘明远
- 关键词：旋毛虫
- 旋毛虫T668基因真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达被引量：1
- 2010年
- 利用RT-PCR技术从中国河南猪旋毛虫(国际标准虫种编号为ISS534)新生幼虫得到T668基因,并克隆入pEGFP-N1真核表达载体中构建重组质粒,该重组质粒在脂质体介导下转染BHK细胞。EGFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,Western blotting鉴定,细胞裂解液样品中有1条约77 000的条带,可被绿色荧光抗体及猪感染旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,表明成功构建T668-pEGFP-N1真核表达质粒,并在BHK细胞融合表达,表达产物具有抗原性。
- 白雪吴秀萍王学林王鑫蕊于建立唐斌刘国兴冯爽陈根元刘明远
- 关键词：旋毛虫真核表达免疫荧光
