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肺结核患者治疗期外周血及病理切片多肽特异性CD4^+T细胞的检测: 2012年; 目的应用四聚体技术研究肺结核患者治疗前后各时间点外周血中E7多肽特异性CD4+T细胞的变化及结核患者肺组织切片中特异性CD4+T细胞的分布。方法培养能稳定分泌表达E7/HLA-DRB1*0404和E7/HLA-DRB1*1602的果蝇S2细胞株,表达纯化获得2种蛋白质单体,并制备成PE标记的相应四聚体,流式细胞分析检测肺结核患者外周血中特异性CD4+T细胞。制备FITC标记的四聚体,对肺结核患者的肺组织切片进行原位染色,观察特异性CD4+T细胞的分布。结果肺结核患者治疗前组及治疗1～60 d组分别与治疗61 d后各组及脐带血组之间的四聚体阳性多肽特异性CD4+T细胞差异均有统计学意义(P<0.05),但治疗前组与治疗1～60 d组之间、治疗61 d后各组之间及分别与脐带血之间、2个四聚体检测组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。在肺结核患者的肺组织切片中可观察到特异性CD4+T细胞。结论制备的2种E7/HLA-DR四聚体对于结核病的检测具有一定的意义,可以用于检测研究肺结核患者治疗前后外周血E7多肽特异性CD4+T细胞的变化及肺结核患者局部病理组织中特异性CD4+T细胞的分布。; 黄利荣李研方毅敏任亮亮朱艳赖小敏; 关键词：结核 HLA-DR 四聚体 CD4+T细胞

应用E7多肽/HLA-DR8四聚体监测治疗前后肺结核患者外周血多肽特异性CD4^+ T细胞的变化被引量：4: 2011年; 目的监测治疗前及治疗6个月内各时间点肺结核患者外周血E7多肽特异性CD4+T细胞及总CD4+T细胞的变化。方法应用已有的果蝇S2恒定细胞株,分别表达、纯化获得2种生物素化E7/HLA-DR8(E7/HLA-DRB1*08032和E7/HLA-DRB1*0818)复合物单体,进而制备成相应四聚体,分别用2种四聚体与抗人CD4-FITC共染色,流式细胞分析检测治疗前以及规律抗结核治疗15、30、45、60、90、120、150、180 d肺结核患者外周血四聚体阳性(E7多肽特异性)CD4+ T细胞及总CD4+ T细胞,同时以健康成人对照者、非结核呼吸道感染患者外周血及脐带血作为研究对照。结果多数病例的外周血总CD4+ T细胞在治疗前略低于正常水平,随着治疗开始很快升高并在短期内恢复至正常水平;但除治疗前组与脐带血差异有统计学意义(P<0.05)外,治疗前后各组之间,以及治疗前组与健康成人、非结核呼吸道感染者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前以及规律抗结核治疗15、30、456、0 d内肺结核患者组外周血可检出高水平的四聚体阳性CD4+ T细胞,与60 d后各组及3个对照组差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05),2种四聚体之间的检测结果无统计学意义(P>0.05);肺结核患者外周血四聚体阳性CD4+ T细胞在治疗前即有较高水平,治疗15~60 d后达到最高,一些患者中间有波动,以后开始逐渐降低甚至降至正常水平。结论多肽/HLA-DR四聚体可以用于监测治疗前后结核患者外周血多肽特异性CD4+ T细胞的变化,配合总CD4+ T细胞的检测,对于治疗期结核患者疾病发展和恢复的监测具有指导意义。; 黎意芬黄利荣刘国标方毅敏李研彭毅赖小敏; 关键词：CD4阳性T淋巴细胞 HLA-DR抗原

应用CD4＋Vα9-J27／Vβ29-D1-J2四聚体检测结核分枝杆菌感染的初步研究: 2012年; 目的初步探讨CD4＋Vα9-J27／V1329-D1-J2TCR四聚体对结核分枝杆菌感染检测的特异性。方法应用果蝇s2恒定细胞株表达、纯化获得生物素化TCR复合物单体制备四聚体。流式检测PE-四聚体与细胞株膜结核抗原肽／HLA-DR复合物以及肺结核患者外周血的单核细胞的结合百分率，并设立病例对照组。激光共聚焦倒置显微镜观察肺结核病理组织及对照组织中四聚体与结核抗原双染阳性的细胞及四聚体与CD14双染阳性细胞。结果四聚体对表达C14／HLA—DRB1＊1504的细胞株结合能力最强。四聚体与结核患者外周血单核细胞结合率显著高于各对照组。结核组织标本可观察到四聚体与CD14双染阳性及四聚体与结核抗原双染阳性的细胞；而对照组织均为阴性。结论CD4＋TCR四聚体对结核检测有一定的特异性，为TCR四聚体应用于结核的诊断和免疫机制研究提供了一定的实验资料。; 谢丹张扣兴杜玄静方毅敏李研陈伊张建波高鸣赖小敏; 关键词：结核病

结核分枝杆菌特异性CD4^＋α／βT细胞受体四聚体筛选细胞系的构建及检测被引量：4: 2009年; 目的构建及应用结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）特异性CD4^＋α／βT细胞受体（TCR）四聚体筛选细胞系。方法从Mtb多肽阳性反应结核患者中，PCR扩增HLA-DRβ链，构建HLA—DRα链和加载有结核抗原肽的HLA—DR仅链全长基因的表达载体pMT—HLA—DRB及pMT-HLA—DRA—P，磷酸钙转染法转入果蝇S2（Schneider2）细胞中进行表达配对，细胞免疫组化法初步鉴定表达情况，并应用所建立细胞系以流式细胞术筛选Mtb特异性CD4^＋α／βTCR四聚体。结果细胞免疫组化法及流式细胞术鉴定显示获得细胞膜上表达结核抗原肽／HLA—DR复合物的稳定S2细胞株，并筛选出2种Mtb特异性CD4^＋α／βTCR四聚体。结论成功构建Mtb特异性CD4^＋α／βTCR四聚体筛选细胞系，为分析鉴定Mtb特异反应性TCR四聚体，探索开发结核诊断新方法及新型结核疫苗的研制提供了工具。; 陈伊任亮亮董涛方毅敏杜玄静黄艳高鸣张娜张建波赖小敏

应用四聚体技术检测肺结核患者外周血及病变组织C5特异性CD4^+T细胞被引量：2: 2012年; 目的:探讨C5特异性CD4+T细胞在肺结核患者外周血及在肺病变组织中的分布。方法:应用四聚体检测肺结核患者外周血及肺病变组织C5特异性四聚体阳性CD4+T细胞,同时以健康成人及非结核呼吸道感染患者外周血和肺炎病变组织作为对照。结果:应用C5/HLA-DRB1*090102四聚体检测肺结核组、非结核呼吸道感染组和健康成人组的C5特异性CD4+T细胞的中位数分别为0.15%、0.09%、0.03%,而C5/HLA-DRB1*130201则分别为0.19%、0.10%、0.04%,肺结核患者组外周血C5特异性CD4+T细胞的中位数高于对照组(P﹤0.05)。在肺结核患者的肺病变组织中可观察到C5特异性CD4+T细胞。结论:四聚体技术可用于结核特异性T细胞的检测,为结核特异性T细胞的进一步研究和应用奠定基础。; 邓向斌黄利荣谢丹李研刘志辉赖小敏谭守勇; 关键词：结核四聚体 CD4+T淋巴细胞

E7多肽的抗原表位特性与多肽反应阳性结核患者的HLA-DR等位基因分析被引量：4: 2011年; 目的:分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)E7多肽的T细胞抗原表位特性,克隆及分析E7多肽反应阳性的结核患者HLA-DR等位基因。方法:应用从结核患者末梢血分离的单个核细胞(PBMC),以IFN-γ-ELISPOT和细胞内细胞因子染色分析MTB E7多肽的T细胞抗原表位特性;从E7-ELISPOT阳性反应的PBMC或胸水细胞中扩增、克隆和分析HLA-DRα和β链等位基因。结果:311例患者IFN-γ-E7-ELISPOT检测显示233例阳性(阳性率75%),阳性结果的平均SFC为210个斑点/106细胞,E7和另一多肽(E6多肽)混合检测529例患者则显示492例阳性(阳性率93%),平均SFC为572个斑点/106细胞;E7多肽刺激后,19例患者的PBMC经细胞内细胞因子染色结果显示能产生IFN-γ的CD4+T细胞百分率为0.63±1.30,而5例健康对照者为0.05±0.056,两者有显著性差异(P<0.004);扩增、克隆出了共有的HLA-DRA*0101和15种HLA-DRB1等位基因。结论:E7是一种理想的广谱HLA-DR限制性CD4+T细胞反应性多肽,为深入研究结核患者的HLA-DRB等位基因的分布特点以及制备相应四聚体建立了基础。; 方毅敏任亮亮李研冯永忠彭毅董涛詹能勇黄宇虹程俊马志明赖小敏; 关键词：结核 HLA-DR

活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析被引量：12: 2007年; 目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。; 张建波方毅敏黄艳江丽芳董涛朱晓敏方丹云赖小敏; 关键词：活动性肺结核 T细胞受体基因重排 CDR3 多重PCR

结核性胸膜炎胸水CD4^+与CD8^+ T细胞的TCR和CDR3谱型分析被引量：5: 2007年; 本研究的目的是了解结核性胸膜炎患者胸水中CD4^＋、CD8^＋T细胞聚集情况，并建立高效、灵敏的TCRα和β链多重PCR扩增方法，扩增出其特异性CD4^＋、CD^＋T细胞的TCRα和β链全长编码序列，研究病变局部特异性克隆增殖TCR的重排特点以及CDR3（complementarity-determining region 3）谱型，可供构建结核分枝杆菌（Mtb）特异反应性TCR四聚体参考。; 黄艳张建波江丽芳方毅敏余新炳董涛朱晓敏方丹云赖小敏; 关键词：CD8^+T细胞结核性胸膜炎 CD4^+TCR 胸水

结核多肽特异性细胞内因子多色流式分析被引量：1: 2013年; 目的建立能同时检测CD3、CD4、CD8表型及胞内因子IFN-γ、IL-4、TNF-α的多色胞内细胞因子染色流式细胞术;评价六条结核特异性多肽的性能。方法将结核患者组及健康对照组的PBMC,用结核特异性多肽或PMA刺激培养后,通过胞内细胞因子流式检测术,收集荧光标记阳性的淋巴细胞等;从而确定各亚群IFN-γ、IL-4、TNF-α阳性细胞的数量及百分率,得出两组间及各多肽间的性能差异。结果 1.各多肽均能刺激活化结核患者PB-MC产生IFN-γ等细胞因子,但百分率较低;IFN-γ及IL-4多数小于1%,而TNF-α则在大约10%左右。与对照组比较,IFN-γ及TNF-α的均值分别高1-12倍或1-3倍,IL-4+/CD4+T淋巴细胞活化率的倍数较小,而IL-4+/CD8+的倍数则较大;2.不同多肽刺激产生细胞内因子的比较:除多肽H256与H210活性能刺激CD4+亚群分泌更多IFN-γ外,其余各多肽刺激产生因子的性能无统计学差异;3.对于IFN-γ及IL-4因子,各多肽均无CD4+或CD8+亚群差异,但各多肽均可刺激CD8+细胞亚群产生更多TNF-α;4.双阳性(IFN-γ及TNF-α阳性)多功能T细胞分析,经多克隆刺激剂(PMA)活化后,IFN-γ+/CD4+及IFN-γ+/CD8+T细胞分别有83.0%及79.9%(均值)为双阳性细胞,而经多肽刺激后则为68.1%及65.7%(均值)。结论多色流式胞内因子染色能很好地检测特异性多功能细胞;所用的6条多肽均能活化结核特异性淋巴细胞产生细胞因子,但细胞因子的活化率较低。; 詹能勇文明明黄慧谦朱秀云刘国辉李美忠张明霞赖小敏; 关键词：流式细胞术细胞免疫 PBMC

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国家自然科学基金(30430660)

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