上海市自然科学基金(12ZR1453500)
- 作品数：8 被引量：11H指数：2
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- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所山东农业大学更多>>
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- H1N1亚型猪流感病毒HA1基因原核表达及鉴定被引量：1
- 2015年
- 本研究利用RT-PCR技术扩增禽源H1N1亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的HA1基因片段,将其连接至p Cold-TF载体上,菌液鉴定为阳性的克隆经测序验证正确后,提取质粒转化至高表达的表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导并大量表达目的蛋白。表达产物经过纯化及SDS-PAGE电泳分析,表明重组蛋白以可溶性形式在上清中大量表达,大小约90 k Da,且在15℃、0.8 mmol/L IPTG条件下诱导24 h表达效果最好。通过Ni柱纯化后,经Western blot分析表明重组表达的蛋白能与禽源H1N1亚型SIV阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。
- 阮宝阳王林宫晓倩汪秀会刘晓敏汪琪单同领李泽君刘芹防陈鸿军滕巧泱童光志于海
- 关键词：HA1基因原核表达可溶性抗原性
- 欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：2
- 2016年
- 本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件：抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1：200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1：40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD450≤0.255和OD450≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制（haemagglutination inhibition,HI）检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD450值的批内变异系数为1.97%-7.85%,批间变异系数为1.94%-6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。
- 阮宝阳王林宫晓倩刘晓敏张鹏汪琪李泽君童光志于海
- 关键词：重组蛋白间接ELISA
- 禽源NA和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响
- 为探究禽源NA和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响,本研究通过对猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07(H1N2)与A/swine/Zhejiang/1/07(H1N1)进行测序以及基因型分析,确定了S12...
- 刘晓敏宫晓倩阮宝阳张鹏汪琪杨海明单同领童武李国新郑浩周艳君童光志于海
- 关键词：重组病毒
- 文献传递
- 重组高产欧亚禽源H1N1亚型猪流感疫苗株的构建与保护效力评价
- 引言 猪流感(Swine influenza,SI)是引起猪急性,高度传染性的一类呼吸系统性疾病,不仅给养猪业带来巨大损失,而且危害人类健康.从我国商品猪体内分离得到H1N1亚型SIV主要是古典猪源H1N1亚型和欧亚禽源...
- 阮宝阳于海王林宫晓倩汪秀会刘晓敏汪琪张鹏李泽君童光志
- 古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立被引量：2
- 2014年
- 利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48 h后收集上清,接种MDCK细胞。当细胞出现明显病变时,收集MDCK细胞上清,其血凝效价为1:64,与原始野生株血凝效价一致;提取拯救病毒的RNA并进行8个目的片段扩增及序列分析,测序结果显示与野生株病毒相同,表明病毒拯救成功。古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立,不仅为探索流感病毒致病机理、感染机制及功能研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研制开辟了新的途径。
- 汪秀会宫晓倩刘晓敏阮宝阳李泽君周艳君童光志于海
- 关键词：RT-PCRH1N1亚型猪流感病毒病毒拯救
- H3N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的建立被引量：1
- 2015年
- 为了构建猪流感病毒A/swine/Heilongjiang/1/2005(H3N2)的反向遗传操作技术平台,利用RT-PCR扩增了H3N2亚型猪流感病毒的8个基因片段,分别连接到pBD双向转录表达载体上。将8个重组质粒纯化后,共转染293T细胞,48h后收集上清,接种MDCK细胞。当MDCK细胞呈现明显病变时,收集上清,做血凝试验,检测出有血凝现象。通过MDCK细胞病变情况、生长曲线、空斑形态等验证拯救病毒的可靠性,结果发现:野生毒株和拯救毒株在MDCK细胞上引起的病变情况基本一致,生长曲线的测定结果没有明显差异,空斑形态也极其相似。H3N2亚型猪流感病毒的成功拯救为猪流感病毒的致病机理、传播机制、基因功能研究以及疫苗研发奠定了基础。
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- 关键词：猪流感H3N2亚型反向遗传操作技术
- 古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立
- 引言利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Guangdong/1/201 1(H1N1)的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48h后...
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- 古典H1N1亚型猪流感病毒PB2 K627E突变对病毒复制能力的影响被引量：1
- 2016年
- 旨在探索古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)PB2K627E突变对病毒复制能力的影响。利用反向遗传操作技术和点突变技术成功获得古典H1N1亚型猪流感病毒的拯救株(627K)和突变株(627E)后,分别在MDCK细胞和小鼠体内对拯救株和突变株的复制能力进行比较。体外MDCK细胞试验结果显示,突变株与拯救株相比,细胞病变(CPE)减小、空斑形态减小、生长曲线差异极其显著,表明突变株在MDCK细胞上的复制能力减弱。小鼠攻毒试验结果表明,突变株对小鼠体重变化的影响不明显,在小鼠肺中的病毒滴度明显下降,引起病理损伤较轻。体外MDCK细胞及小鼠攻毒试验结果均表明,突变株与拯救株相比复制能力降低。该结果不仅证实了猪流感病毒PB2 627位氨基酸是一种重要的毒力分子标记,同时还为进一步阐明其致病机制提供了条件。
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- 猪流感病毒新型核糖体移码蛋白PA-X特有序列的原核表达、纯化及鉴定被引量：3
- 2016年
- 核糖体移码蛋白PA-X是流感病毒的一种新型蛋白,为了研究该蛋白对于猪流感病毒的生物学特性的影响,我们进行了PA-X特有序列的原核表达、蛋白纯化及其鉴定。通过RT-PCR和重叠PCR方法扩增PA-X特有序列的基因,利用基因重组技术构建原核表达载体,并进行菌液PCR和菌液测序鉴定,鉴定正确后克隆转化到BL21(DE3)中,进行蛋白表达及可溶性分析,同时用镍柱亲和层析法对其进行纯化。通过菌液PCR序列鉴定,PA-X特有序列的原核表达载体序列正确,编码框正确。转化BL21后目的蛋白表达成功,且大多数为可溶性蛋白。Western blot结果表明制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应性。
- 宫晓倩阮宝阳刘晓敏张鹏汪琪汪秀会周艳君李泽君童武郑浩童光志于海
- 关键词：猪流感病毒原核表达蛋白纯化BLOT
- H3N2亚型猪流感病毒的反向遗传系统的构建及PB2K627E突变对病毒复制能力和致病力的影响
- 引言 为了探究PB2蛋白的第627位氨基酸对于人源的H3N2猪流感病毒的复制能力和致病力的影响，本实验构建了猪流感病毒A/swine/Heilongjiang/1/2005 (H3N2)的反向遗传操作技术平台，以之为基础...
- 宫晓倩于海汪秀会阮宝阳刘晓敏周艳君郑浩童武李泽君童光志
