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突变灰盖鬼伞过氧化物酶降解刚果红的响应面法优化分析被引量：3: 2014年; 酶法降解偶氮染料刚果红是一个复杂的过程,受温度、pH、酶量、刚果红浓度和双氧水浓度显著影响。为研究各因素及因素间交互作用对刚果红降解影响,提高刚果红的降解率,分别使用单因素法和响应面分析法对刚果红降解条件进行了优化。单因素实验结果显示灰盖鬼伞过氧化物酶降解刚果红的最适条件为:pH 5.0、32℃、酶量4.98 U、双氧水0.1mmol/L、刚果红20 mg/L,此时刚果红最高降解率为34.84%。然后选双氧水浓度、刚果红浓度和灰盖鬼伞过氧化物酶量作为3个因素,通过中心组合设计实验,用响应面法对刚果红降解进行优化分析,最后得到一个拟合度良好的二次多项方程模型(R2=0.9900)。方差分析结果显示,刚果红浓度和酶量是影响最显著的因素,双氧水与酶以及染料与酶之间的交互作用极显著。响应面分析优化后的反应体系为:双氧水浓度0.15 mmol/L,刚果红浓度为27.21 mg/L,酶为2.0 7 U,在此条件下,刚果红降解率达58.13%。; 董冰雪张磊耿三春李运会刘伟詹慧莹贡一峰李鹏远万里; 关键词：单因素分析

宏基因组来源耐Mn^(2+)、热稳定细菌漆酶的分子克隆及酶学特性被引量：3: 2018年; 【背景】漆酶和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)是木质素降解的主要酶,二者有协同效应。Mnp活性依赖于Mn^(2+),而Mn^(2+)是大多数漆酶的抑制剂。【目的】获得耐Mn^(2+)的细菌漆酶用于木质素降解。【方法】构建许昌市某污水河污泥宏基因组文库,通过活性筛选获得细菌漆酶基因lac1542。使用大肠杆菌异源表达Lac1542,研究纯化后的重组蛋白酶学性质并进一步检测了含Lac1542复合酶系降解木质素能力。【结果】测序结果显示lac1542编码一个含513个氨基酸的蛋白。以ABTS为底物Lac1542最适反应pH为4.0,在pH 3.0-6.5范围内酶活性稳定。最适反应温度是75°C,在70°C以下酶活性稳定;100 mmol/L的Mn^(2+)仍能提高酶的活性。动力学参数研究发现,该酶的最适底物顺序为:ABTS>丁香醛联氮>儿茶酚>2,6-DMP>愈创木酚。Lac1542/Mnp复合酶系对木质素降解率为47.8%,比单独使用Mnp木质素降解率(22.4%)提高25.4%。Lac1542/Mnp/灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase,CIP)复合酶系木质素降解高达71.5%,比Mnp/CIP酶系木质素降解率(48.9%)提高22.6%,加入Lac1542后的复合酶系能明显提高木质素的降解率。【结论】Lac1542的可溶性表达、耐受高浓度Mn^(2+)、热稳定性使得Lac1542可以替代一些经典的真菌漆酶应用于制浆、造纸、纤维素乙醇生产、染料脱色等工业。; 董冰雪董冰雪夏敏李鹏李鹏毛润乾; 关键词：酶学特性宏基因组木质素降解

草木灰分散耦合生物发酵对剩余污泥深度脱水被引量：3: 2014年; 利用草木灰分散剩余污泥中高分子聚丙烯酰胺,在耐热耐碱侧胞菌和effective microorganisms(EM)复合菌作用下,对剩余污泥进行生物发酵、深度脱水和除臭等.研究结果表明,添加草木灰(草木灰与污泥体积比1∶3)可分散絮凝剩余污泥(水质量分数约为80%)中的聚丙烯酰胺,并通过耦合生物发酵对剩余污泥进行深度脱水和除臭.处理前后污泥的pH值由6.7增至12.3;污泥比阻(specific resistance to filtration,SRF)由1.41×1013m/kg降为6.85×1011m/kg;污泥中水的质量分数由80.2%降至46.8%;污泥中聚丙烯酰胺质量分数由4.9 mg/g降为0.2 mg/g;臭味强度由5级变为1级;粪大肠菌群值由6.9×107MPN/g降为0.08 MPN/g,处理后污泥中的氮、磷(以P2O5计)、钾(以K2O计)和有机质质量分数分别为3.4%、9.2%、5.7%和49.9%.该方法可有效实现对絮凝剩余污泥的深度脱水,实现污泥的资源化.; 台明青张磊杨希张荣奇程鹏董冰雪; 关键词：固体废物剩余污泥聚丙烯酰胺深度脱水生物发酵

定向进化提高灰盖鬼伞过氧化物酶染织废水脱色效率被引量：3: 2017年; 【目的】获得染织废水脱色能力增强的灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】使用基因合成及定点突变平台合成突变灰盖鬼伞过氧化物酶基因CIPmt4(I49S、V53A、M166F和M242I),并调整密码子至毕赤酵母偏好性。以CIPmt4为模板进行定向进化,经过三轮易错PCR和高通量筛选得到一个酶学性质显著改善的突变体(CIPmt5)。通过3D建模和分子动力学模拟分析蛋白的结构及热稳定性,并进一步研究CIPmt5和野生型CIP对刚果红、氨基黑、甲基橙、次甲基蓝、苯胺蓝、结晶紫、溴酚蓝共7种染料的脱色能力。【结果】序列分析显示该突变体积累了I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F共5个氨基酸突变,与野生型灰盖鬼伞过氧化物酶相比,以ABTS为底物酶活性是野生型的2.01倍(24.44 U/mg),最适反应p H由5.0提高到6.5,最适反应温度由25°C提高到45°C。除次甲基蓝外对其它染料脱色的最适p H都往中、碱性方向偏移,脱色率普遍高于野生型。模型分析显示CIPmt5活性中心更开放,热稳定性增强。【结论】突变体酶CIPmt5能够更好地替代野生型灰盖鬼伞过氧化物酶应用于染织业染料脱色、化工废水和染织废水的生物修复。; 张磊张伟方金涛董冰雪黄林娜吴倩倩押玉柯张建丰张格格郑路; 关键词：定向进化酶学特性染料脱色

固定化灵芝漆酶脱色氨基黑反应体系优化: 2015年; 采用响应面分析法,对固定化灵芝漆酶(Lac)降解氨基黑10B脱色反应体系进行优化分析.首先采用单因素实验分别获取反应体系中6个影响脱色率因素的最佳值;然后通过Plackett-Burman设计法对选取的6个影响因素进行筛选,确定主要影响因素为ABTS浓度和Lac酶量;再用最陡爬坡实验逼近ABTS浓度和Lac酶量2个主要因素的最大响应区域,并通过中心组合设计和响应面分析,确定2个主要影响因素的最佳值.优化后的氨基黑10B脱色200μL反应体系为:pH值4.6、温度30℃、ABTS浓度0.07mmol·L-1、硫酸铜浓度1.75mmol·L-1、Lac酶量6.23mg、初始底物浓度100mg·L-1.该反应体系氨基黑10B脱色率可达60.02%,比单因素法脱色率提高了44.46%.; 方金涛夏敏董冰雪陈彩玉杨玉娇金秀婷董文浩; 关键词：单因素实验

灰盖鬼伞过氧化物酶功能表达及部分酶学特性被引量：1: 2015年; 【目的】旨在用毕赤酵母高效表达灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】借助DNAworks 3.1软件设计、优化引物,用自己构建的基因合成、定点突变平台合成了毕赤酵母密码子偏好性的灰盖鬼伞过氧化物酶基因,测序后构建在表达载体pPICZαA上,整合于巴斯德毕赤酵母GS115染色体,来自酿酒酵母的α因子作为信号肽序列指导重组蛋白的分泌表达。从82个PCR检测为阳性的酵母转化子中筛选出6株高Zeocin抗性的菌进行表达,选表达酶活性最高的作为实验菌株命名为CIP/GS115。【结果】以ABTS为底物时,CIP/GS115在甲醇诱导第4天酶活最高达到487.5U/mL,是目前摇瓶培养诱导表达灰盖鬼伞过氧化物酶活性最高报道。纯化后的酶最适反应温度为25℃,45℃酶反应速度是最适温度时的61.5%,在低于40℃时比较稳定,超过45℃稳定性迅速下降。最适反应pH为5.0,在p H 4.5-6.5之间比较稳定。以不同的底物研究纯酶底物特异性发现最适底物的顺序是:ABTS>愈创木酚>2,6-二甲氧苯酚>2,4-二氯苯酚>苯酚。【结论】灰盖鬼伞过氧化物酶在毕赤酵母中的高效分泌表达和高的特殊活性为该酶在废水处理、染料脱色等方面的工业化应用奠定了一定基础。; 董冰雪牛秋红张伟耿三春李鹏远万里贡一峰梁珂维; 关键词：基因合成毕赤酵母表达

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国家自然科学基金(31300669)

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