国家自然科学基金(30671006)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：姚合斌周丽君陈瑛瑛战大伟徐宏燕更多>>
- 相关机构：中国人民解放军海军总医院安徽医科大学中国人民解放军总医院第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略被引量：1
- 2010年
- 目的构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现。方法采用置换型载体,分为长短、短臂设计(1.5～2.0kb),以便用聚合酶链反应(PCR)方法筛选中靶载体和ES细胞(embrgonic stem cell)。首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变。将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体(BAC)实现同源重组,套取含目的突变点、长约8kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3。将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建。载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据。结果打靶载体符合设计要求。结论运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成。该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定。
- 姚合斌高荣凯王晓英黄火高乔媛媛尚健尹义存
- 关键词：低血钾打靶载体基因敲入同源重组
- 基因敲入小鼠甲亢性低钾型周期性麻痹模型的评价被引量：2
- 2016年
- 目的用基因敲入Ca V1.1-R528H小鼠建立甲亢性低钾型周期性麻痹模型并对其进行评价。方法8周龄基因敲入Ca V1.1-R528H雄性小鼠及8周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠各36只,采用三因素两水平2×2×2析因设计方法按体重随机原则(三因素分别为突变、甲状腺素及胰岛素因素,两水平为有或无)分为8组。其中有甲状腺素处理组的小鼠制备高甲状腺素毒症,按350μg/kg体重连续腹腔注射左旋甲状腺素钠12 d,末次给药后有胰岛素处理组按0.8 U/kg体重给予腹腔注射短效胰岛素,分别检测并记录各组小鼠注射前(0 min)及注射后(30、60 min)的血钾。结果 (1)制备高甲状腺素毒症的小鼠出现烦躁不安、易激怒及毛色枯燥现象,相比对照组,饮食及饮水量明显增多,而体重增加缓慢。甲状腺功能检测显示T3、T4明显高于相应对照组,TSH明显低于相应对照组,且差异均有显著性(P<0.05)。(2)单独给予甲状腺素或胰岛素处理,突变组与野生组血钾同时间点比较并没有统计学差异,而在高甲状腺素毒症下给予胰岛素处理后,突变组与野生组同时间点(30、60 min)比较突变组血钾显著低于野生组(P<0.05)。(3)主效应及交互作用:单独突变因素或甲状腺素因素对血钾并没有作用,仅有胰岛素对降低血钾有作用(P<0.05);甲状腺素因素和突变因素之间以及胰岛素因素和突变因素之间均有交互作用(P<0.05);甲状腺素因素和胰岛素因素之间没有交互作用。结论 (1)高甲状腺素毒症制备成功。(2)利用基因敲入Ca V1.1-R528H小鼠成功的建立了甲亢性低钾型周期性麻痹模型。
- 智红叶徐宏燕陈瑛瑛陈亚宁周丽君战大伟颜克松姚合斌
- 关键词：基因敲入CA胰岛素
