江苏省卫生厅科研基金(H9703)
- 作品数：10 被引量：33H指数：4
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- 相关机构：苏州大学苏州医学院附属第一医院青岛医学院更多>>
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- 急性白血病患者WT1基因异构体的研究被引量：14
- 2002年
- 姚利王玲王玮傅建新岑建农陈子兴
- 关键词：急性白血病
- 竞争性RT-PCR定量检测WT1基因表达方法的建立及初步应用被引量：7
- 2001年
- 王玲傅建新王玮陈子兴
- 关键词：白血病RT-PCRWT1基因表达
- WT1基因异构体WTA对NB4细胞基因表达谱影响的研究
- 2006年
- 目的:探讨WT1基因异构体比例的改变对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4基因表达谱的影响。方法:用电穿孔法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6+转染入白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株NB4/WTA。运用cDNA微阵列技术检测WT1基因异构体表达比例的转变对NB4细胞基因表达谱的影响。并用RTPCR方法验证cyclinA1及CDK7基因表达的改变。结果:转染WT1基因异构体WTA后,外源基因在mRNA及蛋白水平上稳定表达,NB4细胞中共89个细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因出现2倍以上表达水平的改变。RTPCR证实与细胞周期相关的cyclinA1基因表达上调,CDK7基因表达下调。结论:WT1基因异构体WTA表达比例增加能引起NB4细胞基因表达谱的改变,这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生影响。
- 沈慧玲陈子兴王玮岑建农胡绍燕赵晔
- 关键词：NB4细胞
- T-载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用被引量：3
- 2000年
- 目的 探讨克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增产物的简便方法。方法 用PCR方法分别特异性扩增Wilms瘤基因wt1和尿激酶受体 (UPAR)基因 ,并利用Taq聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入T -载体 ,EcoRⅠ酶切鉴定阳性重组子。结果 设计的引物可分别扩增wt1基因锌指区 (34 3bp)和UPAR基因编码区全长 (10 83bp) ;未经修饰的常规PCR和高保真PCR扩增产物可被直接克隆入pGEM -TEasy载体 ,其中正确重组率为 6 2 .5 %～ 87.5 % ;克隆的wt1基因和UPAR基因已被成功用于竞争性PCR或表达。结论 T -载体法是克隆PCR产物通用而有效的方法。
- 傅建新王玲白霞王玮奚晓东陈子兴阮长耿
- 关键词：聚合酶链反应基因克隆
- 地高辛掺入RTPCR半定量检测WT1基因在AML中的表达及其意义被引量：2
- 2000年
- 目的 建立客观的半定量检测WT1基因表达的方法 ,探讨WT1基因表达水平与急性髓细胞性白血病 (AML)预后的关系。方法 用地高辛标记的脱氧三磷酸尿苷 (DIG 11 dUTP)掺入逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)的方法检测 ,用KG 1细胞建立WT1表达的半定量稀释曲线 ,分析5 3例AML及 2 1例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因的表达。结果 倍比稀释的KG 1细胞WT1基因表达水平与稀释倍数有良好的线性关系 ;将WT1基因与 β actin基因的表达水平之比 <0 16定为 (- ) ,≥ 0 16～ <0 6为 (+ ) ,≥ 0 6～ <1 0为 ( ) ,≥ 1 0为 ( )。 2 1例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因均为阴性 ,41例初治AML病人WT1基因表达阳性率为 92 7% ,随着WT1基因表达水平的升高 ,完全缓解 (CR)率有明显下降的趋势 (<0 6及≥ 0 6组比较P <0 0 2 5 )。CR后WT1基因表达水平明显下降 ,复发后又显著升高。结论 DIG掺入RT PCR半定量检测WT1基因表达的方法客观、准确 。
- 王玲王玮傅建新陈子兴
- 关键词：急性髓细胞性白血病地高辛半定量RT-PCR
- Wilms瘤基因WT1表达与急性白血病微小残留病的检测被引量：4
- 2000年
- 近年来发现急性髓性白血病 (AML)有Wilms瘤抑制基因WT1的异常表达 ,且表达水平与预后呈负相关 ,提示其可作为一种新的白血病标志。为探讨WT1能否作为急性白血病微小残留病 (minimalresidualdisease ,MRD)的标志 ,我们采用巢式逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定了WT1基因的灵敏度 ,并与肿瘤特异性标志基因进行比较。所有样本RNA的质量均用内对照c abl基因证实。以两轮RT PCR扩增WT1和肿瘤特异性融合基因检测白血病细胞的极限在NB4细胞分别为 10 -4 和 10 -5,而在K5 62细胞分别为 10 -3- 10 -4 和高于 10 -6 ;在 2 9例供血员的外周血单个核细胞 (MNC)均未检测到WT1基因表达 ,但在 2 1例非恶性疾病患者骨髓MNC中有 8例呈WT1基因阳性 (38.1% )。本研究提示 ,监测WT1表达可用于AML的疗效评价及MRD随访 。
- 傅建新王玲王玮陈子兴
- 关键词：WT1基因NB4细胞系微小残留病白血病
- WT1基因异构体比例转变对白血病细胞株NB4增殖的影响被引量：3
- 2006年
- 背景与目的:WT1基因编码一个锌指转录因子,在白血病细胞中高表达并与预后呈负相关。WT1基因mRNA通过2个可变性的剪切位点产生4种不同的拼接异构体,4种异构体在表达WT1的不同组织中各以其相对稳定的比例表达,白血病细胞中WT1不同异构体表达的意义尚不清楚。本研究拟用WT1基因异构体WTA转导急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4,以探讨WT1基因异构体对NB4细胞增殖的影响及其分子机制。方法:用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6+转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成实验及细胞周期动力学检测,了解WT1基因异构体表达比例改变对NB4细胞生长的影响。用半定量RT-PCR检测NB4细胞中p53、p21、CyclinE、CyclinD1、CyclinA1基因表达的改变。结果:WT1基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染NB4细胞,外源基因在NB4细胞中稳定整合及表达,并通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线,提示转染WT1基因异构体的细胞NB4/WTA生长明显慢于对照组NB4/CMV细胞及未转染的NB4细胞,NB4/WTA细胞生长曲线平缓,在第3天达平台期(78.7±18.0)×104/ml,对照组NB4/CMV细胞及NB4细胞在第4天出现生长平台期达(146.0±21.0)×104/ml。MTT法检测细胞增殖活性,结果显示,NB4/WTA细胞在各个时间段的抑制率均高于对照组,P<0.005。甲基纤维素集落形成试验中NB4/WTA克隆形成率明显下降,集落形成抑制率为46.9%。在As2O3(终浓度0.2μmol·L-1)作用后集落形成抑制更加明显。细胞周期动力学检测提示,NB4/WTA组S期细胞比例升高。RT-PCR检查提示,NB4/WTA细胞p21、CyclinA1基因的表达较对照组升高。结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达将WT1基因异�
- 沈慧玲陈子兴王玮岑建农胡绍燕赵晔
- 关键词：白血病WT1基因异构体NB4细胞增殖细胞周期
- WT1基因表达模式改变对NB4细胞分化的影响被引量：1
- 2005年
- 目的探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4分化的影响及其分子机制。方法用电穿孔法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6+转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株。通过形态学观察,细胞周期动力学检测,NBT还原试验,细胞表面分化抗原CD11b的检测了解外源性WT1基因异构体WTA在全反式维甲酸(ATRA)诱导下对NB4细胞分化的影响。用RT-PCR检测细胞中PML/RARα、p21、c-myc基因表达的改变。结果ATRA处理细胞48h,对照组(转染空载体的NB4/CMV和未转导WTA的NB4细胞)细胞分化明显,NB4/WTA细胞只出现部分分化。流式细胞术检测NB4/WTA细胞CD11b相对荧光强度(4.63±1.63)低于对照组(8.15±1.84),ATRA作用24h后CD11b相对荧光强度(31.42±5.65)与对照组(71.95±9.36)相比差异更为明显。NB4/WTA细胞NBT还原能力较对照组下降,经ATRA处理后两组细胞之间的NBT还原能力的差异更加明显。RT-PCR提示NB4/WTA细胞PML/RARα、p21、c-myc基因的表达较对照组升高。结论增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由+17AA/+KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型能部分抑制ATRA对NB4细胞的诱导分化作用,这可能与PML/RARα、p21、c-myc基因表达上调有关。
- 沈慧玲陈子兴王玮岑建农胡绍燕赵晔
- 关键词：细胞分化NB4细胞分化基因表达模式PML/RARΑRT-PCR检测
- NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化被引量：5
- 2001年
- 为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系 ,应用基因重组技术建立了竞争性RT PCR定量检测WT1基因表达的方法 ,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果发现 ,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降 ,全反式维甲酸(ATRA)作用 0 ,12 ,2 4小时后每 μg总RNA中WT1基因的分子数分别为 4× 10 6,1.5 6× 10 6和0 .4× 10 6,与CD11b的变化情况相一致。结论提示 ,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关 。
- 王玲陈子兴傅建新岑建农王玮
- 关键词：NB4细胞系WT1基因诱导分化白血病
- WT1基因异构体的转导及永久表达白血病细胞株的建立
- 2005年
- 目的将携带WT1基因的4种异构体全长cDNA真核表达载体转导白血病细胞株NB4,为进一步研究WT1基因及其异构体对白血病细胞生物学功能的影响奠定实验基础。方法用电穿孔的方法将携带WT1基因四种异构体全长cDNA的真核表达载体转染白血病细胞株NB4,通过药物筛选获得永久表达细胞株,并将此基因修饰细胞进行单克隆化,通过基因组DNAPCR,RT-PCR及Western印迹法证实外源基因在NB4细胞中的稳定整合及表达。结果WT1基因异构体成功转染白血病细胞株NB4,外源基因在NB4细胞中的稳定整合及表达。结论WT1基因异构体能够通过电穿孔的方法转染白血病细胞并建立永久表达细胞株。
- 沈慧玲陈子兴胡绍燕王玮
- 关键词：异构体白血病NB4细胞
