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国家自然科学基金(81070775)
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汤维芳
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胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管体外共培养体系的建立
2013年
目的获得胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管共培养的条件,在体外建立稳定的神经一肌肉共培养体系,并形成功能性的神经肌肉接头。方法C2C12成肌细胞株体外扩增培养至60%~70%融合时,用分化培养液诱导分化;取孕15~16d的SD大鼠,提取胚胎大鼠脊髓前角运动神经元细胞,种植到分化5d的C2C12肌管细胞中,在神经元基础无血清培养液Neurobasal+2%B27中共培养。倒置显微镜下观察各个阶段神经元形态及突起长度的变化、肌管形态变化及收缩特性、神经肌肉接头的形成,应用免疫荧光染色技术检测突触后膜乙酰胆碱受体(acetyleholinereceptor,AChR)特异性结合物”银环蛇毒素(ccbungarotoxin,α-BTX),并采用屏幕录像技术记录共培养体系中肌肉收缩现象。结果在共培养体系中,原代脊髓运动神经元与C2C12肌管细胞均能存活并进一步分化成熟。3d时,可见运动神经元伸出的轴突延伸至肌管膜表面或包绕肌管;1周时,肌管按同一方向排列,出现广泛的节律性收缩,同时免疫荧光染色结果显示α-BTX特异性结合突触后膜AChR;共培养10d后,运动神经元开始凋亡,肌管细胞逐渐出现萎缩现象。结论在体外培养条件下,无需特殊培养基和各种营养因子,运动神经元和骨骼肌细胞即可共同生存、生长并进一步发育,建立突触连接,触发一系列神经肌肉接头信号转导,引发肌管节律性收缩。
高颖娜
李晓雨
宋先敏
陈世彩
陈东辉
汤维芳
郑宏良
关键词:
运动神经元
肌收缩
共同培养技术
神经肌肉接头
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