“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09401-403)
- 作品数：8 被引量：27H指数：3
- 相关作者：叶丽娟王欣荣曹毅王辂赵志强更多>>
- 相关机构：中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所四川大学中国食品药品检定研究院更多>>
- 发文基金：“重大新药创制”科技重大专项四川省国际科技合作与交流研究计划项目成都市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生轻工技术与工程化学工程生物学更多>>
- 甲氧头孢中间体7-MAC的合成工艺改进被引量：2
- 2013年
- 以7-TMCA(7β-氨基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸)及二苯甲酮腙为原料,制备二苯重氮甲烷,然后再经过二苯甲基保护、缩合、氧化、加成以及取代等5步反应制备了目标化合物7-MAC。并对合成工艺进行了优化,降低了成本和操作难度,提高了产率。
- 李少华魏玮韩增影李宏明曹胜华丁小东
- 人血清抗肺炎链球菌荚膜多糖抗体IgG定量ELISA方法的建立与验证被引量：9
- 2013年
- 目的建立WHO推荐的检测人血清抗肺炎链球菌 （ Streptococcus pneumoniae ）荚膜多糖抗体IgG定量ELISA（PnPSELISA）。方法依照WHO推荐的Pn PS ELISA标准操作要求，优化荚膜多糖的包被浓度，筛选合格的ELISA板和二抗；在检测WHO参考实验室提供的质量控制血清验证实验条件的基础上，分别在WHO参考实验室和兰州生物制品研究所有限责任公司（LIBP）实验室检测16份由LIBP制备的质控血清中抗13种肺炎链球菌血清型（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F）的荚膜多糖IgG抗体浓度。同时，在LIBP实验室建立了实验室内部质控血清907的检测范围，并评价了LIBP实验室实验间检测值的精确度。结果在WHO参考实验室和LIBP实验室分别检测的16份LIBP质控血清的抗13种肺炎链球菌血清型荚膜多糖IgG抗体浓度具有良好的相关关系（slope=0．94，r=0．97，P〈0．05）。LIBP实验室的检测值有81％落在WHO参考实验检测值±40％范围内，符合评价实验室之间所用方法的75％的数据在±40％的检测值范围内的标准。建立了LIBP实验室内部质控血清907的抗13种肺炎链球菌血清型荚膜多糖抗体IgG的检测值范围。LIBP实验室质控血清的各血清型IgG抗体浓度的实验间检测值的变异系数（CV）均〈30％。结论LIBP实验室成功建立了WHO推荐的检测人血清中抗肺炎链球菌荚膜多糖抗体IgG定量ELISA方法，并确定了LIBP实验室日常用质控血清907的检测值范围。
- 王欣茹石继春林纪胜李茂光王春娥刘方蕾叶强赵志强谢贵林
- 关键词：肺炎链球菌酶联免疫吸附试验
- HPLC-ELSD法测定注射用1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中L-赖氨酸的含量被引量：2
- 2013年
- 目的建立注射用1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三．赖氨酸的含量测定方法。方法采用C．。（250mm×4．6mm，5um）色谱柱，以乙腈．甲醇．0．1％Z氟醋酸溶液（2：1：97）为流动相，柱温为室温，流速为1．0mL／min，以蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：105℃，空气做为载气，流速为3．0L／min。结果在0．2066-2．0660μtg范围内，色谱峰面积对数与对照品浓度的对数呈良好的线性关系（F0．9997，n=51；平均回收率为99．78％（RSD=0．71％，n=9）。结论该法简便、可靠、专属性强、重现性好，可做为注射用1，4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射用溶剂中三．赖氨酸含量测定的有效方法。
- 李蔷薇李直王欣荣何正有姚洁李强李维
- 关键词：丁二磺酸腺苷蛋氨酸高效液相蒸发光散射检测器
- 红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质被引量：2
- 2012年
- 【目的】从红纹黄单胞菌中分离纯化了胞内α-氨基酸酯水解酶(AEH),并进行了酶学性质研究。【方法】采用乙酸丁酯破碎细胞,并相继用磷酸钙凝胶沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50阴离子交换处理、CM Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化得到了电泳纯α-氨基酸酯水解酶,并研究了此酶的酶学性质。【结果】SDS-PAGE显示α-氨基酸酯水解酶的亚基分子量为70 kDa。酶促合成头孢克洛的最适pH为6.8,最适温度为42℃,在pH5.0-8.0和35℃以下,酶保持了良好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,Cu2+、Fe2+及高浓度的丙酮对酶活有强的抑制作用。AEH催化D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和头孢克洛水解反应的kcat/Km分别为123.7±3.7 mmol-1.s-1.L、2.9±0.6 mmol-1.s-1.L和101.3±2.1 mmol-1.s-1.L,AEH对D-苯甘氨酸甲酯的催化效率最高。AEH催化双底物反应的机制为乒乓机制,催化合成头孢克洛的kcat为547.3±38.2 s-1。【结论】有关红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对较少,本文的研究将为该酶催化合成β-内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数。
- 屈凤易八贤叶丽娟
- 关键词：Β-内酰胺类抗生素分离纯化酶学性质
- 红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高被引量：2
- 2012年
- 【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。
- 王辂叶丽娟曹毅
- 关键词：热稳定性
- 高产谷胱甘肽酿酒酵母的选育及发酵工艺的研究被引量：6
- 2013年
- 以酿酒酵母SC-001为出发菌株,利用紫外诱变结合乙硫氨酸和氯化锌的底物选择筛选到1株有较高GSH产量的酿酒酵母菌株SC-001-24,其GSH产量为743 mg/L,比出发菌株提高了22%。进一步在10 L发酵罐中考察了不同发酵模式和前体氨基酸补加方式对酿酒酵母产GSH的影响,确定最佳发酵模式为补料分批发酵,最佳前体氨基酸补加策略为:初始培养基加入41 mmol/L半胱氨酸,发酵42 h后一次性补加半胱氨酸246 mmol,甘氨酸160 mmol,谷氨酸82 mmol。在最佳发酵条件下GSH产量达到1 280.4 mg/L。
- 刘哲詹良静张新宜王欣荣
- 关键词：谷胱甘肽酿酒酵母紫外诱变发酵调控
- 全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法被引量：2
- 2012年
- 【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在(0.1?0.6)×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8%?101.3%。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株kcat提高40%以上,4株半失活温度较野生型提高5°C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求。
- 叶丽娟王佳珉王辂曹毅
- 关键词：头孢克洛紫外分光光度法定向进化
- 抗性突变他克莫司高产菌株的选育被引量：5
- 2014年
- 研究利用核糖体工程育种方法结合紫外诱变处理产他克莫司链霉菌SIIA-9818,以期筛选得到发酵水平有较大提高的新菌株。首轮采用链霉素抗性筛选,第二轮组合链霉素和利福平抗性结合紫外诱变育种,进一步巩固育种成效。采用链霉素抗性诱变得到突变株T-122,其气生菌丝丰满程度明显好于原对照株,发酵效价提高22.8%;采用组合链霉素和利福平抗性结合紫外诱变T-122,得到多株高产菌株,其中H-493发酵水平较原出发菌株提高82.6%;在50 L发酵罐通过增大搅拌转速,使菌种H-493发酵单位进一步提高31.0%。本方法简单经济,得到的突变株发酵单位显著提高,组分无明显变化,传代稳定。
- 袁晖张新宜王欣荣
- 关键词：他克莫司发酵
