国家自然科学基金(81101260)
- 作品数：5 被引量：14H指数：1
- 相关作者：张琳惠凌云王亚文冯艾刘正稳更多>>
- 相关机构：西安交通大学医学院第一附属医院西安交通大学西安交通大学第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 鸭肝组织中DHBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法的建立被引量：1
- 2014年
- 目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X＋48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.
- 王亚文惠凌云张琳冯艾王威马列婷王全颖杨广笑刘正稳
- 关键词：鸭乙肝病毒CCCDNA实时荧光定量PCR
- 鸭肝组织中DHBcAg表达水平定量免疫组织化学方法的建立被引量：1
- 2014年
- 目的：建立鸭肝组织中鸭乙肝病毒核心抗原（DHBcAg）表达水平定量的免疫组织化学方法。方法比较热修复、微波修复、胃蛋白酶修复和不修复四种不同抗原修复方法的免疫组化检测技术，建立 DHBcAg抗原修复的最佳方案。采用Image-Pro Plus 6.0软件，设置优化图像采集参数，通过扣除空白区域的面积计算二氨基联苯胺（DAB）黄染的平均光密度（MD），客观评价不同切片中阳性表达的程度。采用该方法对 DHBV感染的鸭肝组织中 DHBcAg表达水平进行定量，评价DHBcMAb-TAT PTD穿膜抗体的抗病毒作用。结果抗原不修复的方式进行 DHBcAg免疫组化染色优于其他三种抗原修复的方法。建立优化的图像采集参数，进行DHBcAg抗原表达的 MD值计算。比较受试麻鸭治疗前后肝组织中DHBcAg的 MD差值，结果显示随着DHBcMAb-TAT PTD穿膜抗体给药剂量的增加，鸭肝细胞内 DHBcAg的表达逐渐降低，存在明显剂量依赖关系。表明该方法可有效评价药物对DHBcAg的影响。结论建立DHBcAg抗原不修复的定量免疫组织化学方法可以更加客观、准确的评价DHBcAg表达水平。
- 王亚文刘希惠凌云巩辉张琳马列婷韩水平王全颖杨广笑刘正稳
- 关键词：免疫组织化学PLUS
- 针对鸭乙肝病毒C基因设计的Taqman实时荧光定量PCR方法
- 目的针对鸭乙肝病毒C基因保守区,建立检测DHBV-DNA的通用性Taqman实时荧光定量PCR方法。方法比较GenBank中所有国内、外报道的北京麻鸭DHBV Core区的核酸序列,采用DNASIS V2.5软件筛选出最...
- 王亚文惠凌云冯艾王威张琳马列婷王全颖杨广笑刘正稳
- 关键词：鸭乙肝病毒C基因
- 文献传递
- 抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的制备抗鸭乙肝病毒core蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。方法 PCR扩增鸭乙肝病毒(DHBV)core基因片段,构建表达载体pET28a(+)/DHBV core。转化诱导表达融合蛋白,用Ni 2+亲和柱纯化目的蛋白。免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选,采用有限稀释法筛选单克隆杂交瘤细胞并进行细胞克隆。体内诱生法大量制备单克隆抗体,进行抗体的特异性、效价和亚型的鉴定。结果成功构建表达载体pET28a(+)/DHBV core,并表达DHBV core蛋白。获得2株稳定分泌抗DHBV core抗体的杂交瘤细胞株,分别为2D7和5G10,细胞培养液抗体效价为1∶400和1∶800。选择5G10细胞株制备单克隆抗体,小鼠腹水抗体效价可达1∶320 000。鸭肝组织免疫组化结果显示,DHBV病毒载量>1010copies/mg的肝组织中DHBV core蛋白的表达明显高于病毒载量<105copies/mg的肝组织,而未感染DHBV的鸭肝细胞内不表达DHBV core蛋白。亚型鉴定结果为IgG2aκ链。结论制备并获得了抗DHBV core蛋白的单克隆抗体,为DHBV core蛋白的功能研究、诊断试剂的研制与抗病毒治疗研究奠定了基础。
- 王亚文刘正稳张琳冯艾王威王全颖杨广笑惠凌云
- 关键词：鸭乙肝病毒核心蛋白单克隆抗体细胞克隆
- CHB 患者疾病进程与抑郁症的程度及血清 BDNF 水平的相关性被引量：11
- 2015年
- 目的：研究慢性乙型肝炎（CHB）患者在疾病进展的不同阶段并发抑郁症的程度以及血清脑源性神经营养因子（BDNF）的水平。方法选择 HBV 病毒携带者（ASC 组）、肝硬化（LC 组）和肝癌（HCC 组）不同病程的患者126例和40例正常对照为研究对象，采用调查问卷调查研究对象人口学资料，以汉密尔顿抑郁量表（HAMD-17）进行评分和抑郁分级，同时采用 ELISA 法检测血清 BDNF 水平。结果LC 组、HCC 组离异或丧偶的比率高于对照组（χ^2＝6.354，11.972；P 值均＜0.01）；ASC 组、LC 组、HCC 组抑郁严重程度的分布均高于对照组，差异有统计学意义（χ^2＝16.151，42.150，49.636；P值均＜0.01）；同时，ASC 组抑郁严重程度低于 LC 组和 HCC 组，差异有统计学意义（χ^2＝14.345，28.772；P 值均＜0.01）；ASC，LC，HCC 和对照组 BDNF（x ±s ，ng／ml），分别为11.10±3.26，8.66±3.11，7.39±2.52和12.18±2.59，LC 组和HCC 组血清 BDNF 水平显著低于 ASC 组和对照组，差异有统计学意义（P 值均＜0.01）；CHB 病程的进展与 HAMD 评分存在正相关关系（r＝0.719，P ＜0.01），与 BDNF 水平存在负相关关系（r＝－0.504，P ＜0.01）；血清 BDNF 水平与 HAMD评分存在负相关关系（r＝－0.526，P ＜0.01）。结论CHB 疾病的进程可使抑郁的程度加重，BDNF 水平逐渐降低。提示血清 BDNF 水平可作为 CHB 患者心理治疗的实验室参考依据。有望提高临床医生对 CHB 患者伴随抑郁症发生的识别，提高诊疗效果。
- 惠凌云王凌张琳冯艾李娜李义平王亚文
- 关键词：慢性乙型肝炎抑郁症脑源性神经营养因子
- 阿德福韦酯对鸭乙肝病毒cccDNA的抗病毒作用研究
- 2015年
- 目的探讨阿德福韦酯(ADV)对鸭乙肝病毒cccDNA的抑制作用。方法采用ADV(10mg·kg-1·d-1)和0.01mol·L-1PBS(0.5mL·kg-1·d-1)治疗感染鸭乙肝病毒(DHBV)的北京麻鸭。分别在治疗第0,10,20和30d和停药15d时,检测外周血DHBVDNA的载量和外周血AST和ALT水平。并分别于治疗前、治疗30d和停药15d分别通过手术、B超引导下的肝脏穿刺取鸭肝组织,检测DHBV DNA和DHBV cccDNA载量。结果外周血DHBV DNA载量ADV阳性药物组分别在治疗10,20和30d均显著低于治疗基线(P<0.05),并随着治疗时间延长,DHBV DNA呈下降趋势。停药15d,虽与治疗基线比较仍有显著性差异(P<0.05),但病毒复制有反弹现象。在治疗20,30d和停药15d时,ADV治疗组均显著低于PBS阴性对照组(P<0.05)。肝组织DHBV DNA载量,ADV阳性药物组治疗30d时明显低于阴性对照和治疗基线(P<0.05),但停药15d后,肝组织中的DHBV DNA有所反弹,与治疗基线和阴性对照比均无显著性差异(P>0.05)。肝组织DHBV cccDNA治疗抑制率在治疗30d和停药15d后,ADV阳性药物组均明显高于阴性对照(P<0.05)。表明ADV可有效抑制DHBV cccDNA的复制,停药15d后虽能够有效地维持抑制作用,但有所反弹。AST和ALT结果显示,ADV阳性药物组各时间点与基线之间,以及与PBS对照组之间均无统计学差异(P>0.05)。结论 ADV可有效抑制DHBV DNA和cccDNA的复制。但停药后仍有反弹。提示临床ADV治疗HBV应长期、联合用药,才能最终治愈乙肝。
- 惠凌云罗秦英张琳冯艾李娜王威李义平王亚文
- 关键词：阿德福韦酯抗病毒
