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重组人尿激酶原在CHO细胞中的高效表达及其纯化: 2012年; 用鸡β-globin的MAR序列和人看家基因延伸因子1α(hEF-1α)的调控序列以及旱獭RNA稳定与输出序列,构建了重组人尿激酶原(recombinant human pro-urokinase,rhPro-UK)的高效表达载体,在CHO细胞中获得了rhPro-UK的高效稳定表达,rhPro-UK的表达水平达到1 299 IU(以百万细胞1 d的表达量计)。采用阳离子交换层析、疏水层析和凝胶排阻层析的三步工艺纯化表达rhPro-UK的CHO细胞培养上清液,rhPro-UK的纯度达到98%、回收率为60%～70%。; 李世崇叶玲玲刘红张正光高丽华胡显文陈昭烈; 关键词：CHO细胞重组人尿激酶原纯化

CHO工程细胞(11G-S)悬浮培养的无血清培养基的设计被引量：6: 2010年; 以悬浮适应的表达重组尿激酶原(Pro-urokinase,pro-UK)CHO工程细胞系11G-S为对象,采用Plackett-Burman实验设计及响应面分析法,设计支持CHO工程细胞(11G-S)悬浮生长的无血清培养基。以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计对影响细胞生长的培养基添加成分进行考察,确定了3种对细胞生长明显促进作用的培养基添加成分:胰岛素、转铁蛋白及腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种适用于CHO工程细胞(11G-S)悬浮培养的无血清培养基SFM-CHO-S。11G-S细胞在SFM-CHO-S批次悬浮培养的细胞最大生长密度达到4.12×106cells/mL,pro-UK的最大累积活性达到5614IU/mL,培养效果优于商品化的同类无血清培养基。; 刘兴茂刘红叶玲玲李世崇吴本传王海涛谢靖陈昭烈; 关键词：CHO工程细胞无血清培养基

中国仓鼠卵巢工程细胞无血清流加培养关键工艺参数的考察被引量：1: 2011年; 主要考察流加培养基中不同营养成分、流加起始时间及初始接种密度对11G-S细胞无血清流加培养的影响。在研究中以悬浮适应的表达尿激酶原（Pro-urokinase,Pro-UK）CHO工程细胞系11G-S为研究对象,在100 mL的摇瓶中无血清悬浮流加培养11G-S细胞,同时以活细胞密度、细胞活力及Pro-UK活性为评价依据。结果表明在培养基中氨基酸、无血清添加成分及无机盐对促进细胞生长、细胞活力维持及蛋白表达起着较为重要的作用;且流加起始时间为72 h及初始接种密度为3×105~4×105 cells/mL的流加培养效果较好。在为期12 d的流加培养过程中,11G-S细胞的最大活细胞密度达到7.8×106 cells/mL,Pro-UK的最大累积活性为8 570 IU/mL。在此基础上,分别考察了无血清悬浮流加培养及分批培养11G-S细胞的生长及代谢特征,流加培养中期11G-S细胞的比生长速率（μ）高于同期批次培养的11G-S细胞;流加培养中后期11G-S细胞的葡萄糖比消耗速率（qglu）和谷氨酰胺比消耗速率（qgln）均高于同期批次培养的11G-S细胞。; 刘兴茂刘红叶玲玲李世崇吴本传王启伟陈昭烈; 关键词：CHO工程细胞无血清培养流加培养工艺参数代谢特征

批次和流加培养中国仓鼠卵巢工程细胞的细胞周期相关基因转录谱分析: 2011年; 以表达人重组尿激酶原中国仓鼠卵巢(CHO)工程细胞系11G-S为研究对象,运用基因芯片技术比较了CHO工程细胞在批次及流加培养不同生长阶段基因表达水平的差异,在此基础上采用Genmapp软件,同时结合已知的细胞周期信号通路图,着重分析了批次及流加培养CHO工程细胞的细胞周期调控基因转录谱差异。在基因芯片涉及的19 191个目标基因中,批次和流加培养不同生长阶段CHO工程细胞的下调表达的基因数量多于上调表达基因数目;两种培养模式下的基因差异表达有着明显的不同,尤其是在细胞生长的衰退期,流加培养CHO工程细胞中下调表达的基因数量明显多于批次培养。有关调控细胞周期关键基因的转录谱分析表明,CHO工程细胞主要是通过下调表达CDKs、Cyclin及CKI家族中的Cdk6、Cdk2、Cdc2a、Ccne1、Ccne2基因及上调表达Smad4基因,来达到调控细胞增殖及维持自身活力的目的。; 刘兴茂叶玲玲刘红李世崇王启伟吴本传陈昭烈; 关键词：细胞培养细胞周期

CHO工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型被引量：4: 2010年; 以悬浮适应的表达尿激酶原CHO工程细胞为研究对象,在100mL的摇瓶中进行无血清悬浮培养,以细胞密度、细胞活力、Pro-UK活性、葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生产速率(qlac)、乳酸对葡萄糖的得率系数(Ylac/glc)为观察指标,同时以细胞有血清悬浮培养作为参照,考察CHO工程细胞无血清悬浮培养生长和代谢特征。观察结果表明,CHO工程细胞在无血清及有血清悬浮培养条件下表现为大致相似的细胞生长和代谢特征。在此基础上,依据实际检测的数据,应用MATLAB软件对细胞对数生长期的细胞生长、乳酸生成及葡萄糖消耗的模型参数进行非线性规划,获得全局性收敛的最优参数估计值,建立了细胞在无血清培养条件下的生长及代谢动力学模型。; 刘兴茂刘红叶玲玲李世崇吴本传王海涛谢靖陈昭烈; 关键词：CHO工程细胞无血清培养基代谢动力学

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用被引量：4: 2011年; 逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1（＋）表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度（Relative fluorescence intensity,RFI）均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C（Recombinant human activated protein C,rhAPC）基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15μg/（106 cells.d）的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。; 叶玲玲许建李世崇刘红刘兴茂王启伟陈昭烈; 关键词：逆转录病毒外源基因生物技术药物

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“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09503-011)