湖北省教育厅青年基金(200524003)
- 作品数：3 被引量：14H指数：2
- 相关作者：张功礼邓长康王家宁潘国栋施永彦更多>>
- 相关机构：郧阳医学院附属人民医院武汉大学更多>>
- 发文基金：湖北省教育厅青年基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达被引量：6
- 2009年
- 目的:构建携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒质粒pAd-GFP,制备重组腺病毒Ad-GFP,并使GFP在血管平滑肌细胞中得到高效表达。方法:将线性化的穿梭质粒pRNAT-H1.1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在感受态BJ5183内进行同源重组,并筛选出阳性重组子pAd-GFP;用Pac I酶切线性化pAd-GFP,线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增。采用CsC1密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化。获得的腺病毒感染人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC),观察其感染效率和GFP表达水平。结果:通过Pac I酶切证实腺病毒载体构建成功,包装出携带GFP基因的腺病毒,滴度达到4.5×1012pfu/mL,获得的腺病毒对hVSMC的感染效率约为100%。结论:利用细菌内同源重组方法成功地构建了携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒,并能够在hVSMC细胞中高效地表达,为利用GFP作为报告基因的研究奠定了实验基础。
- 张蕾王家宁郭凌郧孔霞杨建业唐俊明黄永章郑飞
- 关键词：报告基因绿色荧光蛋白人血管平滑肌细胞RNA干扰
- 腺病毒介导神经生长因子在绿色荧光蛋白基因标记的间充质干细胞中表达及意义被引量：6
- 2006年
- 目的为提高间充质干细胞(MSCs)表达神经生长因子(NGF)的能力,同时使MSCs 被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过病毒载体将NGF和GFP基因高效转染到MSCs的方法。方法取2个月龄100～150 g Wistar大鼠,全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带人 NGFβ基因的复制缺陷性重组腺病毒(Ad-hNGFβ)和携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(Rt- GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs,免疫细胞化学和Western blot检测hNGFβ的表达。结果 Rt-GFP转染后,80％～90％MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。Ad-hNGFβ的转染MSCs中hNGFβ阳性率(90．17±2．14)显著高于阴性对照组(2．17±0．75,P<0．01)和空白对照组(1．83±0．98,P<0．01),转染后MSCs中NGFβ表达量(188．67±8．71)显著高于阴性对照组(25．67±4．08,P<0．01)和空白对照组(27．50± 3．33,P<0．01)。结论 Ad-hNGFβ可以高效转染MSCs,实现NGF在MSCs中高效表达,Rt-GFP 可以使MSCs获得长效标记。
- 施永彦喻爱喜张功礼余永桂邓长康潘国栋
- 关键词：骨髓问充质干细胞神经生长因子绿色荧光蛋白基因转染
- 逆转录病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染标记间充质干细胞被引量：2
- 2005年
- 目的:为使间充质干细胞(MSCs) 被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法,以便为研究在体干细胞分化奠定基础.方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(Rt-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs.结果:Rt-GFP 转染后,80%～90% MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减.结论:Rt-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记.
- 施永彦王家宁张功礼潘国栋余永贵邓长康
- 关键词：骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白逆转录病毒载体
