广东省自然科学基金(001032)
- 作品数：5 被引量：3H指数：2
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- 相关机构：南方医科大学南方医院南方医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序被引量：2
- 2006年
- 目的通过对抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因3-5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3-5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果获得2113bpPCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5'端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3'端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复(GGCTTATATTTAA)连接断裂点两端。结论推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。
- 钟敏潘速跃陆兵勋姜立李伟
- 关键词：肌营养不良症基因缺失
- 克隆缺失连接片段——一种基于PCR技术的缺失型假肥大型肌营养不良症的携带者检测
- 2008年
- 目的依据dystrophin基因缺失后断端重接可形成一段变异的DNA序列，提出一种利用缺失连接片段进行缺失型假肥大型肌营养不良症携带者检测的新方法。方法实验以来自广东省肇庆地区的一个Becker型肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）家系为研究对象，其中2例确诊的男性BMD患者，3例待诊的女性携带者，1例待诊的人工流产绒毛。先证者经外显子PCR检测确定第3．5外显子缺失，随后采用PCR步移法在相应内含子设计引物定位断裂点的位点，最后利用靠近断裂点设计的引物直接对家系的6例基因组DNA进行缺失连接片段的PCR扩增和测序。结果6例基因组DNA均扩增出阳性的产物片段且连接片段的测序序列完全一致，绒毛的性别诊断结果为女性，可以确诊本家系中的3个女性和流产绒毛均为缺失型BMD携带者。结论作者成功地将整个家系患者和携带者的缺失连接片段进行克隆和测序分析，实现了利用缺失连接片段对缺失型假肥大型肌营养不良症携带者进行准确基因诊断的设想，同时对在产前诊断上的应用前景进行了探讨。
- 钟敏潘速跃陆兵勋李伟
- 关键词：肌营养不良基因诊断
- 在Dystrophin基因大内含子上定位缺失突变位点的策略被引量：1
- 2006年
- 目的:探讨在Dystrophin基因大内含子上准确定位缺失突变位点的方法。方法:实验于2005-02/05南方医科大学南方医院神经内科实验室内完成。选择2例临床证实为男性假肥大型肌营养不良症患者,通过外显子聚合酶链反应检测证实其5’端断裂点分别位于Dystrophin基因庞大的44号和2号内含子。在44号和2号内含子上先各设计5对引物将内含子序列人为地分成长度大致均等的6个待查区域,经第一次聚合酶链反应检测确认断裂点所在区域后继续在该区域每3kb序列设计1对引物,在第2次聚合酶链反应步移法检测中若相邻2对内含子引物1对扩增出正常阳性结果而另1对扩增为阴性结果,即为内含子上断裂点的近似位置。结果:以5对初步定位引物进行聚合酶链反应检测后确定以上2例假肥大型肌营养不良症患者5’端断裂点位于44号内含子第5区和2号内含子第6区,在该2个区域进行第二次聚合酶链反应步移法检测,准确定位断裂点分别大致位于44号内含子178kb左右以及2号内含子153kb左右的位点处。结论:分次聚合酶链反应步移法定位Dystrophin基因大内含子上缺失突变位点的方法更为简便,对位于大内含子上基因缺失连接片段的准确快速克隆具有重要意义。
- 钟敏潘速跃蔡丽丹陆兵勋张国忠
- 关键词：内含子基因缺失
- 假肥大型肌营养不良患者dystrophin基因缺失断裂点的分子结构特点被引量：2
- 2007年
- 目的分析假肥大型肌营养不良患者 dystrophin 基因缺失断裂点的分子结构特点,探讨 dystrophin 基因缺失的发生机制。方法以 PCR 步移法定位2例 DMD 患者基因断裂位点,克隆其缺失连接片段并测序,通过 Pubmed 文献检索获取既往55例缺失连接片段序列资料,对以上57例缺失连接片段5′端和3′端断裂点两侧的序列进行重复序列、基质附着区、TTTAAA 序列以及基因缺失后修复方式的分析。结果 57例缺失连接片段中40.4%断裂点位于重复序列,其中主要是 L1元件和Alu 元件;36.3%断裂点在邻近基质附着区5 kb 之内的区域;15.0%断裂点两侧50 bp 的范围内发现有 TTTAAA 序列;基因缺失后修复的方式仅1例通过 Alu 元件同源连接,其余56例通过非同源末端连接进行修复,非同源末端连接以形成1～4 bp 的微小同源序列为主。结论重复序列、基质附着区、TTTAAA 序列以及非同源末端连接修复机制均在一定程度上参与 dystrophin 基因的断裂重组。dystrophin 基因缺失可能是由以上多种因素的综合作用所导致,染色体的物理结构可能在基因缺失中起主要作用。
- 钟敏潘速跃陆兵勋
- 关键词：肌营养不良蛋白基因缺失
- dystrophin基因第45 ~54外显子缺失连接片段的克隆和测序(英文)被引量：3
- 2006年
- 目的通过对dystrophin基因第45-54外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析，探讨dystrophin基因缺失的发生机理。方法先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）患者第45～54外显子缺失，然后在第44和第54内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点，最后用靠近断裂位点处设计的引物，以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序，测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果对扩增连接片段的PCR产物测序获得2716bp有效序列。本例基因缺失片段长达402kb。5’端断裂点位于第44内含子长散在元件（long interspersed elements，LINE）L1序列内，邻近基质附着区（matrix attachment region，MAR），3’端断裂位点在第54内含子较可能形成MAR的一个次级区域内，附近有拓扑异构酶Ⅱ识别位点，断裂点两旁存在6bp的回文序列。连接片段通过4bp的微小同源序列AGAG连接断裂点两端。结论由L1重复序列、断裂点附近拓扑异构酶Ⅱ酶切位点、MARs以及微小同源序列的非同源末端连接修复等综合因素引起的非同源基因重组可能是导致此一大片段基因缺失的重要原因。
- 钟敏潘速跃陆兵勋李伟
- 关键词：肌营养不良症基因缺失
