广东省卫生厅资助课题(B2004047)
- 作品数：5 被引量：10H指数：3
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- 人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达被引量：3
- 2005年
- 【目的】构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF_(165))基因的重组腺病毒载体并观察其在 C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础。【方法】将 VEGF_(165)基因克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV,获得重组质粒 pAdTrack VEGF_(165)。经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 共同转染大肠杆菌 BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒 pAdCMV VEGF_(165),转化体外培养的 C17.2神经干细胞。通过 RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot 法检测其在 C17.2神经干细胞中的表达。【结果】重组腺病毒 AdCMV VEGF_(165)在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×10^(11)efu/mL。病毒上清液经 ELISA 检测VEGF_(165)表达的量为(1135±138)ng/L。重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达。【结论】成功构建 pAd VEGF_(165)重组腺病毒,获得了稳定表达 VEGF_(165)的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础。
- 沈庆煜黎祥喷陶恩祥肖颂华王莉梅邢诒刚
- 关键词：血管内皮生长因子腺病毒科神经干细胞
- 人血管内皮生长因子165基因转染对C17.2神经干细胞体外增殖分化的影响被引量：1
- 2005年
- 目的:构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体,并观察其对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响。方法:将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165,转染体外培养的C17.2神经干细胞。以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组。通过酶联免疫吸附测定检测其在C17.2神经干细胞中不同时间段的表达。C17.2神经干细胞培养24h后,将pAdCMVGFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组),24,48,72h后每孔加入四氮唑盐10μL,检测pAdCMV转染对C17.2神经干细胞增殖的影响。将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白,pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞设为对照2组。收集C17.2神经干细胞(C17.2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞组),对两组细胞进行培养,将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定,行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测。结果:①重组腺病?
- 沈庆煜王艺东李梅黎祥喷吕瑞妍肖颂华王莉梅邢诒刚
- 关键词：干细胞转染
- NURR1基因修饰C17.2神经干细胞移植治疗脑梗死被引量：3
- 2007年
- 目的:比较C17.2神经干细胞和NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对脑梗死模型鼠神经功能缺损的改善效果,观察细胞移植后与宿主脑组织的整合、存活、移行及分化情况。方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。①实验材料:选取清洁级健康SD雄性大鼠78只,随机数字表法分为模型对照组、神经干细胞组、转基因神经干细胞组,26只/组。条件永生化神经干细胞系C17.2由哈佛大学儿童医院Even Synder教授惠赠。pAdeasy-NURR1重组复制缺陷性腺病毒由本实验室成功构建。Dil18荧光染料(Chemicon公司产品)。②实验方法:收集C17.2神经干细胞和pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞,各分为两管,一管加入Dil18荧光示踪剂。各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,3d后进行细胞移植,以江湾Ⅱ型脑立体定向仪进行立体定位,选择缺血半暗区3个位点为移植区:前囟头侧1mm,旁开2mm,深度1.2mm;前囟尾侧3mm,旁开1.5mm,深度1.2mm;前囟尾侧6mm,旁开2mm,深度1.2mm。模型对照组每位点注射单纯培养液2μL;神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的C17.2神经干细胞悬液2μL,剩余20只每位点移植C17.2神经干细胞悬液2μL;转基因神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2μL,余20只每位点移植pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2μL。③实验评估:各组大鼠分别在移植前1d及移植后1周、2周、1个月进行神经功能缺损评分。移植后1周、2周、1个月进行荧光示踪检查及神经元特异烯醇化酶免疫组化检测。移植后6个月行组织学检查。结果:移植后1周,模型对照组死亡1只,神经干细胞组死亡2组,转基因神经干细胞组死亡2只,均淘汰并予以补充。①神经功能缺损评分:移植前1d各组大鼠神经功能缺损评分基本相似(P>0.05)。移植后1周、2周、1个月神经干细胞组、转�
- 黎祥喷沈庆煜王艺东叶剑虹邢诒刚
- 关键词：NURR1基因脑梗死C17.2神经干细胞
- 腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响被引量：3
- 2005年
- 【目的】探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。【方法】体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型;将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞;Western-blot法检测VEGF蛋白的表达;流式细胞术测定细胞凋亡率;Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体。【结果】转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98%±0.55%),转染pAdCMVVEGF165后的细胞凋亡率为(10.38%±0.48%,P<0.01),而转染pAdCMVVEGF165+VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07%±0.64%),与对照组无显著差异(P>0.05)。【结论】腺病毒介导的VEGF165基因能成功表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存。
- 沈庆煜吕瑞妍李梅王莉梅肖颂华邢诒刚
- 关键词：神经干细胞凋亡腺病毒载体
- 血管内皮生长因子基因修饰C17．2神经干细胞移植治疗脑梗死的实验研究被引量：2
- 2007年
- 目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因修饰神经于细胞(NSC)移植治疗脑梗死大鼠模型的治疗效果,以及基冈的表达情况和神经保护作用。方法通过移植腺病毒载体介导的VEGF165基因转染的C17.2 NSC到大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)的局灶性脑缺血模型脑梗死半暗带区,观察移植后大鼠神经功能变化,神经特异性烯醇化酶(NSE)、CD31免疫组化检查观察细胞存活分化和血管新生情况。结果VEGF病毒组、NSC移植组和VEGF基因修饰NSC组神经功能严重度评分均较对照组显著减少(P<0.05),以VEGF基因修饰NSC组最为显著(P<0.05);NSC移植后NSE阳性细胞数较对照组显著增多(P<0.05),VEGF基因修饰NSC组更为显著(P<0.05);VEGF病毒组和VEGF基因修饰NSC移植组脑梗死灶周围血管数较对照组显著增多(P<0.05),以VEGF基因修饰NSC组更为显著(P<0.05)。结论转染VEGF基因的C17.2 NSC脑内移植治疗MCAO脑梗死模型可促进NSC向神经元分化,可促进新生血管形成,改善神经功能。VEGF基因修饰NSC移植治疗效果优于单纯的C17.2 NSC移植或VEGF基因治疗。
- 沈庆煜肖颂华李梅吕瑞妍王艺东邢诒刚黎祥喷
- 关键词：血管内皮生长因子神经干细胞脑梗死
