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hPdx1和△-hPdx1蛋白表达系统的构建及功能鉴定: 2012年; 经鉴定成功构建了hPdx1和△-hPdx1蛋白表达系统,IPTG诱导蛋白表达后Western blot检测在37.2-52.3 kD之间出现了与两种目的蛋白理论分子量相符的蛋白条带。诱导后破碎菌体上清液,经分离纯化最终得到的目的蛋白纯度可达到95%以上。纯化的蛋白加入人胚胎干细胞培养基中1 h后通过细胞免疫荧光检测发现,hPdx1蛋白可进入细胞而△-hPdx1不能进入细胞,表明表达得到的蛋白具有生物活性。; 王小莉梁清乐李东升; 关键词：蛋白表达

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定被引量：4: 2014年; 目的:建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法:收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果:采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论:人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。; 胡培王小莉李东升严世荣陈玲杨晓文; 关键词：人脐带间充质干细胞原代培养

体外合成EGFP的mRNA转染人脐带间充质干细胞的稳定性研究被引量：2: 2013年; 目的鉴定人脐带间充质干细胞(hUCMSC),通过体外修饰增加体外合成mRNA转染hUCMSC的稳定性。方法流式细胞仪检测hUCMSC免疫表型,油红O和碱性磷酸酶染色分别进行成脂、成骨分化鉴定。体外合成EGFP的mRNA经polyA尾、帽子结构及碱基等方面的修饰转染hUCMSC,流式检测荧光强度。Trypan blue染色观察mRNA转染对细胞活性的影响。结果 hUCMSC高表达CD29、CD44、CD105,低表达CD34、CD45、HLA-DR,且向成脂、成骨方向分化。通过一系列修饰体外合成EGFP的修饰mRNA稳定性更好,且mRNA转染与DNA相比对细胞毒性更小。结论体外合成的mRNA经一系列的修饰后稳定性大大提高,可进入hUCMSC翻译成蛋白。; 王小莉胡培刘志祥袁雅红李东升; 关键词：MRNA 修饰人脐带间充质干细胞稳定性

小鼠胰岛的分离和移植: 2014年; 目的改进小鼠胰岛分离和移植方法。方法利用胆总管穿刺方法灌注胰腺,滤网过滤后人工挑取方法纯化胰岛;采用肾被膜下胰岛移植方法进行移植;用双硫棕(DTZ)染色方法鉴定分离纯化后的胰岛并计数;血糖仪动态检测胰岛移植后糖尿病小鼠血糖值;免疫组织化学染色观察肾脏被膜下胰岛存活情况。结果分离纯化后获得高纯度胰岛,可被DTZ染成猩红色,呈圆形或椭圆形;经计数每只小鼠可获胰岛(134±12)个;肾脏被膜下胰岛移植后血糖检测显示,移植胰岛后糖尿病小鼠可长期维持正常血糖值,移植胰岛在小鼠体内发挥了正常功能;免疫组织化学染色显示移植入的胰岛生存状态良好。结论依改进后的技术方法进行胰岛分离和移植,分离获得的胰岛纯度高、活力强,移植物功能正常、存活时间长,是一种简捷稳定的技术方法。; 袁雅红卢智勇王小莉杨卓顺李东升; 关键词：胰岛分离胰岛移植小鼠

利用Dispase高效分离胰岛的实验研究被引量：1: 2015年; 目的如何获得高质量、数量充足的小鼠胰岛细胞。方法通过比较当前研究中使用的大多数消化酶来分离小鼠胰岛,证实相继使用XI型胶原酶和Dispase比单独使用前者更为有效。结果可获得更多的胰岛细胞(增加至40%)、更短的消化时间(下降25%),并且使用较少的胶原酶(减少40%)。结论这一新改良的方案在小鼠胰岛分离的质量、数量方面都有明显改善。; 马石楠李万哲郭兴荣袁雅红李东升; 关键词：胰岛分离胶原酶

大鼠Ins1基因启动子区域DNA甲基化状态的研究被引量：3: 2012年; 目的:研究大鼠Ins1(Insulin 1)基因启动子在各种组织中DNA甲基化的状态及在转化分化过程中甲基化的变化情况,为从表观遗传学方面研究Ins1基因表达调控的机制奠定基础。方法:通过RT-PCR检测大鼠胰岛、大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)及大鼠肝干细胞(WB)中Ins1基因的表达情况。采用重亚硫酸盐测序法分析这三种细胞位于转录起始位点上游400 bp的Ins1基因启动子区域DNA甲基化的状态,并用焦磷酸测序法分析大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪和肝脏组织的甲基化状态及WB细胞转入PDX1慢病毒后甲基化的变化情况。结果:大鼠胰岛和INS-1细胞中Ins1基因高表达,启动子区域的甲基化程度非常低,而在大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪、肝脏组织和WB细胞中Ins1基因不表达,启动子区域的甲基化程度很高,当WB细胞转入PDX1慢病毒后可使Ins1基因启动子区域的甲基化程度降低。结论:Ins1基因的表达受甲基化调控,PDX1单个转录因子虽可降低Ins1基因甲基化程度但并不能使其完全去甲基化并表达Ins1基因。; 王小莉尹世学刘乔江德巧江德巧; 关键词：DNA甲基化

体外合成修饰mRNA可转染hUC-MSCs被引量：1: 2013年; 目的探讨体外合成修饰的mRNA能否稳定高效的转入人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)中,为利用mRNA诱导分化hUC-MSC进行细胞治疗奠定基础。方法体外构建合成mRNA的模板并合成eGFP的修饰mRNA,将其转入hUC-MSCs,流式检测转染效率、最佳转染剂量及mRNA在细胞中的半衰期。相同方法合成hPdx1修饰mRNA转染hUC-MSCs,免疫荧光检测转染效果。结果体外合成的eGFP修饰mRNA可高效转入hUC-MSCs,最佳转染剂量为1.5μg/mL,转染后翻译的蛋白在细胞中可稳定存在3 d。hPdx1的修饰mRNA也可稳定地导入hUC-MSCs。结论体外合成的修饰mRNA稳定性好,可进入细胞并翻译成蛋白。; 王小莉李大哲胡培李东升; 关键词：转染效率

Nanog过表达对宫颈癌细胞分化程度的影响: 2014年; 目的:研究Nanog过表达对宫颈癌Hela细胞分化程度的影响。方法:体外合成Nanog mRNA并转染Hela细胞,使其过表达Nanog。检测转染后Nanog蛋白的表达、体外侵袭、迁移、体内成瘤及肿瘤干细胞球形成能力。结果:转染mRNA后,Hela细胞Nanog表达明显升高,体外侵袭和迁移能力明显提高。接种至裸鼠后成瘤能力也明显增强。经无血清培养液诱导后形成的肿瘤球明显多于正常对照组,且球的体积较大。肿瘤球细胞表达Nanog及CD133,进一步诱导可以分化为脂肪细胞。RT-PCR检测多能性相关基因的表达,发现转染Nanog mRNA可以激活内源性的Nanog,OCT4,Sox2及Fox D3。结论:Nanog可能通过调节多能性相关基因的表达来影响宫颈癌细胞的分化程度。; 丁妍王治校王小莉郭兴荣袁雅红李成林李东升; 关键词：NANOG 宫颈癌 MRNA 肿瘤干细胞

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国家自然科学基金(81070614)