前期杂交优化后赤芝菌种经液体深层发酵后,提取灵芝菌丝体多糖,并过DEAE-Sepharose Fast Flow柱分离纯化,利用高效体积排阻色谱(HPSEC)检测多糖级分的纯度,采用完全酸水解PMP柱前衍生化RP—HPLC测定多糖级分的单糖组成,多角度光散射仪联用装置(SEC—MALLS)测定其绝对重均分子量(Mw),并且根据分子旋转半径与分子摩尔数的关系曲线斜率初步推断其空间构象。结果显示:分离纯化得到3个多糖级分GLMP1、GLMP2和GLMP3,HPSEC检测其峰面积百分比分别为93.58%,97.64%,99.19%,单糖组成分析结果表明GLMP1、GLMP2和GLMP3均含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖,但单糖摩尔比各异。SEC—MALLS测试GLMP1、GLMP2和GLMP3的Mw分别为4.526×105,4.603×104,3.760×103 g/mol,3个多糖级分构象可能均为高度紧缩且具有分支结构的聚合物。
采用水浴回流法提取灵芝孢子粉粗多糖,再依次使用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶色谱柱分离纯化得到2种多糖组分GLP1a和GLP1b,HPSEC法测得2种组分均呈单一峰,重均分子量分别为1.12×106和1.21×105。HPLC、红外光谱和核磁共振分析的结果表明,GLP1a和GLP1b主要由葡萄糖组成,主链都是以β-(1,6)糖苷键连接,GLP1b在部分1→6连接的葡萄糖的3位和4位有分支。MTT实验表明,2个多糖级分均具有一定的免疫活性,而且都存在明显的量效关系,GLP1b的免疫活性明显高于GLP1a。
