国家质检总局科技计划项目(2007IK017)
- 作品数：5 被引量：30H指数：4
- 相关作者：李光才邱海洪鲁兴萌张弘蔡顺风更多>>
- 相关机构：浙江大学浙江中医药大学浙江中医药大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家质检总局科技计划项目浙江省科技厅项目浙江省重大科技专项基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR检测灵敏度试验被引量：3
- 2011年
- 蚕微粒子病检测技术是该病防治中的一项重要技术,本文在通过破碎法提高模板核酸获取量的基础上,对纯化家蚕微粒子虫孢子的PCR检测灵敏度进行了测试。提取核酸-模板稀释测试12对引物的灵敏度中有4对引物达到0.05粒(102粒/mL)、4对引物5粒(104粒/mL)、1对引物50粒(105粒/mL)、2对引物500粒(106粒/mL)和1对引物5000粒(107粒/mL)。两对灵敏度较高的引物(NbZS004F/NbZS004R和NbZS007F/NbZS007R)灵敏度临界值(0.05粒和0.005粒)的PCR重复检测率均为90%。纯化家蚕微粒子虫孢子稀释后提取核酸再进行PCR检测试验中,NbZS004F/NbZS004R和NbZS007F/NbZS007R的灵敏度分别为:5粒(104粒/mL)和0.5粒(103粒/mL)。
- 李光才蔡顺风何祥康何欣怡马焕艳孟祥坤邱海洪何永强鲁兴萌
- 关键词：家蚕微粒子病孢子聚合酶链式反应
- 不同DNA抽提方法对普通PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫的影响被引量：9
- 2011年
- 为了优选快速、灵敏、特异的家蚕微孢子虫Nosema bombycis分子检测方法和DNA抽提方法,本文通过对家蚕微孢子虫TaqMan探针荧光定量PCR检测方法和SYBRGreen荧光定量PCR检测方法的建立以及反应体系优化,并与普通PCR方法进行比较;再采用4种不同DNA抽提方法分别对PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫悬浮液的效果评价。结果显示:不经过DNA抽提,直接将家蚕微孢子虫发芽液进行PCR反应的效果优于其他方法,检测灵敏度由高到低依次为直接法、酚/氯仿抽提法、动物组织DNA试剂盒抽提法和植物组织DNA试剂盒抽提法;TaqMan探针法检测家蚕微孢子虫发芽液的灵敏度和SYBRGreen法相近,达到微孢子102个/mL,两者均优于普通PCR方法。实验表明,直接采用发芽液结合荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫最为简便、快速、灵敏。该研究结果将有助于提高家蚕微粒子病监控技术和检疫能力,对家蚕微粒子病的检疫和防治具有积极意义。
- 何永强吴姗鲁兴萌邱海洪帅江冰张晓峰王素华徐国群李光才董强
- 关键词：家蚕微孢子虫荧光定量PCR家蚕微粒子病检疫
- 单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别新甲型H1N1及甲型和乙型流行性感冒病毒被引量：6
- 2012年
- 目的建立和评价鉴别新甲型H1N1、甲型和乙型流行性感冒（简称流感）病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法。方法2010年10月至2011年4月，采集流感样患者咽拭子样本213份。分别选用新甲型H1N1流感病毒HA基因、甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NP基因中的152、128和107bp片段作为荧光定量PCR检测的靶片段，设计特异性引物和不同发光基团标记的TaqMan探针，采用体外转录构建标准品，绘制标准曲线，评价检测方法的重复性、特异度和灵敏度，并对213份流感样患者咽拭子样本进行检测及测序验证。结果3种病毒对应的标准曲线分别为：新甲型H1N1流感病毒：Y=-3．461gX＋46．985；甲型流感病毒：Y=-3．491gX＋37．709；乙型流感病毒：Y=-3．51lgX＋38．889，Y为Ct值，lgX为病毒RNA拷贝数的对数值。质粒标准曲线的方差系数为0．998，灵敏度达到每个反应10^2拷贝／μl，特异度强。213份样本中检出新甲型H1N1流感病毒核酸39份（18．3％），甲型流感病毒核酸阳性63份（29．6％），乙型流感病毒核酸阳性23份（10．8％），阳性样品经过测序验证。结论为鉴别新甲型H1N1、甲型和乙型流感病毒建立的单管多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏。
- 张弘何永强张严峻王真李榛
- 关键词：流感病毒A型流感病毒B型
- 一种快速高效制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法被引量：12
- 2011年
- 家蚕微孢子虫孢子壁坚厚不易破碎,并对许多化学物质有很强的抵抗性,使用常规的核酸和蛋白抽提方法效果不够理想。研究建立玻璃珠破碎法快速制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法,采用琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE分析所得DNA的完整性和所得总蛋白的差异性,并对提取蛋白进行双向电泳试验。结果表明:使用玻璃珠破碎法对微孢子虫孢子壁的破碎率可达到90%以上,基因组DNA得率约为7.65 fg/粒,总蛋白得率约为788.3 fg/粒,均显著高于常用的发芽法和液氮冻融研磨法的得率。双向电泳结果显示玻璃珠破碎法能有效提取家蚕微孢子虫总蛋白,经考马斯亮蓝染色可检测到约350个蛋白点,蛋白信息丰富,可进一步用于质谱分析。
- 蔡顺风何欣怡何祥康邱海洪李光才何永强鲁兴萌
- 关键词：家蚕微孢子虫核酸蛋白双向电泳
- 家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法及诊断试剂盒被引量：9
- 2011年
- 基于为蚕种生产与流通贸易提供快速、灵敏、准确检测家蚕微孢子虫的方法,以家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因66 bp片段作为靶标,设计特异性引物和TaqMan探针,用构建的重组质粒制备标准品进行荧光定量PCR扩增,通过优化PCR反应体系,测定线性范围,评价方法的特异性、灵敏度和重复性,成功构建了家蚕微孢子虫的荧光定量PCR检测方法,并研制出诊断试剂盒。该方法的检测线性范围为1×108～1×102拷贝/mL的7个线性梯度,检测家蚕微孢子虫的敏感度达1×102拷贝/mL,特异性高,3次重复性检测应用试验的批内变异系数为3.6%～7.2%,批间变异系数为5.2%～7.8%。结果表明,建立的家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法具有准确、灵敏、快速、特异性强的特点。
- 何永强吴姗鲁兴萌张弘邱海洪帅江冰王素华张晓峰徐国群李光才董强
- 关键词：家蚕微孢子虫荧光定量PCR诊断试剂盒
