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microRNA-194模拟物对成骨肉瘤细胞系SOSP_9607生物学特性的影响被引量：2: 2011年; 目的:观察miR-194模拟物对于成骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-194模拟物(hsa-miR-194mimics)转染成骨肉瘤细胞系SOSP_9607,增强SOSP_9607细胞内miR-194的活性。结果:与对照组比较,实验组细胞的增殖能力明显下降。实验组凋亡率(10.1±0.22)%与阴性对照组凋亡率(3.3±0.19)%相比明显增高(P<0.01)。与对照组比较,实验组细胞周期G0/G1细胞比例显著增加,G2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少(P<0.01)。结论:通过转染miR-194模拟物增强SOSP_9607细胞中miR-194的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡造成显著影响。; 靳雷高杰刘云燕马琼杨彤涛裘秀春范清宇马保安; 关键词：骨肉瘤细胞增殖细胞凋亡

microRNA和干细胞的研究进展被引量：3: 2007年; 目的介绍microRNA（miRNA）起源、功能及其与干细胞的关系的研究进展。方法查阅近年有关文献，并对miRNA和干细胞进行综合分析。结果miRNA是一类非编码蛋白并且参与转录后调节的单链小分子RNA（20～25个碱基），对基因表达具有重要调控作用。近年来发现存在着一个庞大的miRNA家族，参与调控生物体生长发育等许多复杂的生命过程，并且与干细胞的自我更新和多向分化存在着紧密关联。结论miRNA作为一种新的调控基因表达的小分子RNA，可以成为干细胞研究的新途径。; 高杰杨彤涛裘秀春范清宇马保安; 关键词：MICRORNA 干细胞基因调控

miR-424在人骨髓间充质干细胞分化过程中的表达被引量：5: 2010年; 目的筛选可作为人骨髓间充质干细胞（MSCs）分子标记物的microRNA（miRNA）.方法以从骨髓中分离培养的MSCs及其诱导分化的成骨细胞和软骨细胞为实验对象,利用基因芯片检测miRNA的表达情况,由芯片显著性分析（SAM）得到MSCs较其诱导分化细胞高表达的miRNA,再由实时定量PCR进行验证.结果成功分离培养出MSCs,并分别诱导其分化为成骨细胞和软骨细胞;MSCs及由其诱导分化的成骨细胞和软骨细胞经miRNA芯片检测及SAM分析得到8个MSCs较由其诱导分化的成骨细胞高表达miRNA（has-miR-424、has-miR-34a、has-miR-593、has-miR-10a、has-miR-148a、has-miR-602、mmu-miR-709、mmu-miR-665）,3个MSCs较由其诱导分化的软骨细胞高表达miRNA（has-miR-424、PREDICTED_MIR189、mmu-miR-665）.其中MSCs较成骨细胞和软骨细胞均高表达的人源性miRNA为has-miR-424,差异倍数分别为6.6倍和4.4倍;在原样本中对进行实时定量PCR的验证,结果提示与诱导分化的成骨细胞相比,MSCs中的has-miR-424表达升高约3.6倍,而与诱导分化的软骨细胞相比,MSCs中的has-miR-424表达升高约3.1倍,结果与芯片结果相符合.结论 MSCs较其诱导分化细胞高表达的miRNA有望成为人骨髓间充质干细胞的一种特异性的分子标记物,这些miRNA对MSCs自我更新和未分化状态起着重要的维持作用.; 高杰韩建伟朱洪繁杨彤涛范清宇马保安; 关键词：骨髓间充质干细胞 MICRORNA

成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证被引量：19: 2007年; 背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系。本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证。方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),多聚腺苷酸化和5′连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR4-TOPO载体上得到大约109bpDNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况。根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证。结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166)。选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达。结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系。; 高杰杨彤涛裘秀春鱼兵韩建伟范清宇马保安; 关键词：骨肉瘤 MICRORNA 克隆 NORTHERN BLOT

mirRNA-17-5p抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响被引量：1: 2010年; 目的:探讨miR-17-5p抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,进一步计算抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-17-5p抑制物(hsa-miR-17-5pinhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-17-5p的活性。结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01)。随着浓度从50nmol/L逐渐增加至200nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01)。实验组凋亡率(9.6±1.8)%与阴性对照组凋亡率(3.5±0.4)%相比明显增高(P<0.01)。结论:miR-17-5p抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-17-5p的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用。; 赵广义赵健高杰许啸闫康吴家昌杨彤涛马保安; 关键词：骨肉瘤细胞增殖细胞凋亡

人骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的实验研究被引量：11: 2010年; 目的创伤等因素造成的关节软骨的损伤和退变是骨科常见和难以解决的问题之一。干细胞尤其是骨髓来源干细胞的研究促进了组织工程在骨关节领域的发展。文中研究体外单层培养条件下,成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)经诱导定向分化软骨细胞可行性。方法用全血贴壁法分离培养BMSC,并传代扩增后,用单层培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养21 d,以常规培养液培养的BMSC作为阴性对照。光镜下观察诱导细胞形态学的改变,苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化等方法检测诱导细胞的分泌功能。结果BMSC经21 d的单层诱导培养后,细胞形态由长梭形向多角形类圆形转变,细胞爬片甲苯胺蓝染色呈明显异染,Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学检测阳性,对照组阴性。结论成人BMSC在单层培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。; 吴家昌杨彤涛许啸文艳华韩建伟范清宇马保安; 关键词：人骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞

miR-21真核表达载体的构建及其活性鉴定被引量：4: 2009年; 目的:构建miR-21的真核表达载体,并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达,为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础。方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中,并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析,鉴定完全正确的重组质粒转染骨肉瘤细胞MG63,G418(400 mg/L)筛选4周获得miR-21稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcDNA3.1(+)-miR-21可在真核细胞中过表达。结果:成功构建了miR-21的真核表达载体,并获得稳定转染重组质粒的细胞系。结论:miR-21的真核表达载体在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达,为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。; 赵健闫康高杰赵广义杨彤涛范清宇马保安; 关键词：PCDNA3.1(+)真核表达载体 MIR-21 转染

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达被引量：6: 2008年; 目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。; 高杰杨彤涛裘秀春韩建伟范清宇马保安; 关键词：骨髓间质干细胞细胞微RNAS

人miR-34a真核表达载体的构建及其表达被引量：5: 2009年; 目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并使其在骨肉瘤SOSP-9607细胞中表达。方法:从人骨肉瘤SOSP-9607细胞基因组DNA中用PCR法扩增出miR-34a的前体序列,并引入酶切位点和保护碱基,双酶切后定向插入真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,构建miR-34a真核表达载体pcD-NA-miR34a,然后进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。同时用构建好的载体pcDNA-miR34a转染骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系,用Northern blot及realtimeRT-RCR法鉴定pcD-NA-miR34a可于真核细胞中过表达miR-34a的生物学特性。结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pcDNA-miR34a。pcDNA-miR34a可于骨肉瘤SOSP-9607细胞中上调miR-34a的表达,获得了miR-34a高表达骨肉瘤细胞系。结论:miR-34a的真核表达载体可在骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞中有效表达,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。; 闫康赵健高杰许啸杨彤涛裘秀春范清宇马保安; 关键词：微RNAS MIR-34A 基因表达骨肉瘤

人骨髓间充质干细胞不同亚群增殖分化的研究被引量：4: 2009年; 为比较不同亚群的人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cell,hBMSC)自我更新和分化能力,通过获赠的人髂骨骨髓标本,联合运用密度梯度离心和差异贴壁法分离MSCs,用10μm滤膜将不同群体细胞分离,倒置相差显微镜观察不同亚群细胞的形态;流式细胞仪检测BMSC不同亚群细胞的表型;在地塞米松、Vit C、β-磷酸甘油钠作用下将不同亚型细胞向成骨细胞诱导分化,分别观察其分化能力。结果成熟的MSC,即mMSCs细胞(mature cells)呈纤维样梭形,RS细胞(rapidly MSC self-renewing cells)呈圆形。RS细胞增殖能力明显强于mMSCs。经定向诱导分化后,RS细胞向成骨细胞分化能力较mMSCs细胞强。说明RS细胞较之mMSC细胞可能是一种更原始的中胚层前体细胞,具有更强的自我更新和分化潜能。; 许啸高杰吴家昌马琼刘云燕文艳华闫康杨彤涛马保安; 关键词：间充质干细胞细胞分化

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